Integration af tarmorganoider hos hunde og et mikrofluidisk system Gut-on-a-Chip tilbyder relevante translationelle modeller for humane tarmsygdomme. De præsenterede protokoller giver mulighed for 3D-morfogenese og dynamisk in vitro-modellering af tarmen, hvilket hjælper med udviklingen af effektive behandlinger for tarmsygdomme hos hunde og mennesker med One Health.
Hundetarme har ligheder i anatomi, mikrobiologi og fysiologi med menneskers, og hunde udvikler naturligt spontane tarmlidelser svarende til mennesker. At overvinde den iboende begrænsning af tredimensionale (3D) organoider i adgangen til den apikale overflade af tarmepitelet har ført til dannelsen af todimensionale (2D) monolagskulturer, som udsætter den tilgængelige luminale overflade ved hjælp af celler afledt af organoiderne. Integrationen af disse organoider og organoidafledte enkeltlagskulturer i et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system har videreudviklet teknologien, hvilket giver mulighed for udvikling af mere fysiologisk relevante dynamiske in vitro-tarmmodeller .
I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol til generering af 3D-morfogenese af hundens tarmepitel ved hjælp af primære tarmvævsprøver opnået fra hunde, der er ramt af inflammatorisk tarmsygdom (IBD). Vi skitserer også en protokol til generering og vedligeholdelse af 2D-monolagskulturer og tarm-på-en-chip-systemer ved hjælp af celler afledt af 3D-tarmorganoiderne. De protokoller, der præsenteres i denne undersøgelse, tjener som en grundlæggende ramme for etablering af et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system, der er specielt designet til hjørnetænder. Ved at lægge grunden til denne innovative tilgang sigter vi mod at udvide anvendelsen af disse teknikker i biomedicinsk og translationel forskning i overensstemmelse med principperne i One Health-initiativet. Ved at udnytte denne tilgang kan vi udvikle mere fysiologisk relevante dynamiske in vitro-modeller til studier af tarmfysiologi hos både hunde og mennesker. Dette har betydelige konsekvenser for biomedicinske og farmaceutiske anvendelser, da det kan hjælpe med udviklingen af mere effektive behandlinger af tarmsygdomme hos begge arter.
Intestinal epitelmorfogenese er i vid udstrækning blevet undersøgt gennem laboratoriedyremodeller, som er dyre, tidskrævende og ikke nøjagtigt repræsenterer menneskelige udviklingsprocesser1. Desuden mangler konventionelle statiske 2D-cellekulturmodeller evnen til at efterligne den komplekse rumlige organisering af en 3D-epitelarkitektur2. Som følge heraf er der behov for en protokol til at inducere in vitro 3D-morfogenese ved hjælp af tarmepitelceller fra menneskerelevante dyremodeller for at fremme vores forståelse af tarmepitelarkitektur.
Selskabshunde har udviklet tarmanatomi og mikrobiomsammensætninger, der bemærkelsesværdigt ligner mennesker på grund af deres fælles miljø og kost under domesticering3. Ud over denne lighed deler både mennesker og hunde forskellige kroniske sygeligheder, der menes at tilskrives tarmsundheden. Hunde, som mennesker, kan spontant udvikle kroniske tilstande som fedme, kognitiv dysfunktion, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og kolorektal adenocarcinom 4,5,6,7,8,9,10. På trods af udviklingen og brugen af humane og murinepitelceller i tidligere Gut-on-a-Chip-undersøgelser 2,11,12,13,14 er hundens tarmepitel ikke blevet brugt indtil nu. Vores nye tilgang, der bruger tarmorganoidepitel hos hunde i et dynamisk kultursystem med en 3D-epitelmorfogenese, har betydelige konsekvenser for både hunde- og humanmedicin.
Nylige fremskridt inden for intestinal organoidkultur har ført til etablering af hundetarmorganoidkultur15. Dette dyrkningssystem involverer dyrkning af tarmstamceller under defineret morfogenkonditionering, hvilket resulterer i en 3D-model med selvfornyende egenskaber afledt af voksne stamceller16. Imidlertid udgør udførelse af transportanalyser eller værtsmikrobiom-cokulturer vanskeligheder med denne 3D-model på grund af den lukkede karakter af tarmlumen17. For at løse dette har forskere genereret et 2D-monolag afledt af tarmorganoider, hvilket muliggør eksponering af lysoverfladen18,19. Imidlertid opretholdes både 3D-organoider og 2D-monolag under statiske forhold, som ikke nøjagtigt afspejler in vivo-biomekanikken i tarmmikromiljøet. Kombinationen af patientafledt teknologi til organoider hos hunde med in vitro 3D-morfogenese giver mulighed for translationel forskning i kroniske multifaktorielle sygdomme. Denne tilgang gør det muligt for forskere at udvikle mere effektive behandlinger til gavn for både mennesker og hunde og yderligere fremme translationel forskning, der er i overensstemmelse med One Health-initiativet, som er en samarbejdstilgang, der anerkender sammenhængen mellem menneskers, dyrs og miljøets sundhed. Det fremmer tværfagligt samarbejde for at tackle komplekse sundhedsudfordringer og opnå optimale sundhedsresultater for alle. Ved at forstå den indbyrdes afhængighed mellem mennesker, dyr og økosystemer sigter initiativet mod at afbøde risici fra nye infektionssygdomme, miljøforringelse og andre fælles sundhedsproblemer20,21,22.
Denne protokol skitserer omfattende metoder til dyrkning af tarmepitelceller fra hunde opnået fra patientorganoider på en Gut-on-a-Chip-mikroenhed med en polydimethylsiloxan (PDMS) -baseret porøs membran. Etablering af 3D-epitelmorfogenese ved at integrere tarmorganoider hos hunde og denne Gut-on-a-Chip-teknologi gør det muligt for os at studere, hvordan tarmen udvikler og vedligeholder sin cellulære organisation og stamcelleniche. Denne platform giver en værdifuld mulighed for at undersøge virkningen af mikrobiomsamfund på tarmsundhed og forstå, hvordan disse samfund genererer mikrobielle metabolitter, der bidrager til intestinal patofysiologi14,23. Disse fremskridt kan nu udvides til hundetarmprøver, hvilket giver forskere mulighed for at udforske det indviklede forhold mellem tarmmikrobiomet og værtsfysiologien. Dette åbner muligheder for at få værdifuld indsigt i de underliggende mekanismer i tarmpatofysiologi og forstå den potentielle rolle mikrobielle metabolitter i både hunde og menneskers sundhed samt forskellige sygdomstilstande. Protokollen, der anvendes til hunde Gut-on-a-Chip, er reproducerbar, hvilket gør den til en passende eksperimentel model til komparativ medicin, da denne tilgang muliggør undersøgelse af værtsmikrobiominteraktioner, patogeninfektioner og probiotiske-baserede terapeutiske virkninger hos både hunde og mennesker.
Denne undersøgelse markerer den banebrydende demonstration af kompatibiliteten af hundetarmorganoider med udviklingen af en IBD Gut-on-a-Chip-model til hunde. Integrationen af tarmorganoider og organoidafledte enkeltlagskulturer i et mikrofluidisk system (dvs. Gut-on-a-Chip-systemet) har videreudviklet teknologien og muliggjort oprettelsen af in vitro-tarmmodeller , der nøje efterligner fysiologisk dynamik og er mere repræsentative for biologiske forhold. Især da der er meget få rapporter om Gut-on-a-Chip-kultur ved hjælp af IBD-afledte organoider hos mennesker, kan den nuværende undersøgelse ved hjælp af IBD-afledt Gut-on-a-Chip hos hunde give førende indsigt i undersøgelsen af IBD hos mennesker.
Den vellykkede udvikling af hundetarmepitel 3D-morfogenese på en Gut-on-a-Chip kræver omhyggelig opmærksomhed på flere kritiske trin. For det første kan den hydrofobe overflade af PDMS-mikrofluidiske kanaler hæmme ECM-vedhæftning og efterfølgende cellefastgørelse, hvilket nødvendiggør overfladeaktivering af PDMS før ECM-belægning og cellesåning (se protokolafsnit 1). For at opnå en stabil enkeltlagskultur er fjernelse af overskydende ikke-bundne celler afgørende efter cellevedhæftning (protokoltrin 4.6-4.7). Derudover er dynamisk stimulering, såsom konstant medium flow og peristaltisk-lignende vakuumbevægelse, nødvendig for 3D-morfogenese af tarmepitelet (protokoltrin 5.2). Omhyggelig håndtering er afgørende for at undgå luftbobler i mikrokanalen under alle trin i Gut-on-a-Chip-kulturen.
Hvis du støder på dårlig cellesåning i Gut-on-a-Chip, kan det skyldes et lavt cellenummer eller dårlig cellevedhæftning. For at fejlfinde lave celletal er det vigtigt at inspicere sundheden hos forberedte tarmorganoider ved at observere deres vækst i Matrigel. Cellelevedygtighed kan vurderes ved Trypan blå farvning efter celledissociation for at sikre, at ikke mere end 20% af cellerne er døde. Hvis levedygtige cellenumre er utilstrækkelige, kan optimering af organoidmedieforhold forsøges. En anden mulighed er ufuldstændig organoid dissociation, hvilket resulterer i et overskud af celleklumper større end 70 μm, der bliver fanget af filteret. For at løse dette er en mulighed at forlænge varigheden af pipettering under celledissociation. Alternativt kan det 15 ml koniske rør forsigtigt omrøres hvert minut, mens det behandles med en trypsinlignende protease. Dårlig cellefastgørelse til Gut-on-a-Chip kan skyldes forkert ECM-belægning. Under belægningsprocessen anbefales det omhyggeligt at kontrollere tilstedeværelsen af luftbobler og forhindre deres dannelse ved forsigtigt at tilføje mere belægningsopløsning efter behov. Overfyldning af celler og manglende vask af ikke-bundne celler kan resultere i et utilstrækkeligt indledende monolag. I et sådant tilfælde kan en mild pulsering påføres, når sprøjtestemplet trykkes på. Disse fejlfindingstrin kan hjælpe med at identificere og løse problemer under Gut-on-a-Chip-kulturprocessen.
Mens denne Gut-on-a-Chip-platform muliggør oprettelse af bølgede 3D-epitellag, anerkender vi behovet for yderligere biologisk kompleksitet for at replikere tarmmikromiljøet fuldt ud. Det er afgørende at overveje interaktionerne mellem epitel- og mesenkymale celler, aflejringen af ECM til 3D-regenerering og tilstedeværelsen af krypt-villus-egenskaber, der etablerer en passende stamcelleniche. Stromaceller, såsom fibroblaster, spiller en afgørende rolle i produktionen af ECM-proteiner og reguleringen af intestinal morfogenese34,35,36. Inkluderingen af mesenkymale celler i denne model har potentialet til at forbedre både morfogenese og effektiviteten af cellebinding. Endotellag, der omfatter kapillær vaskulatur og lymfekar, spiller en afgørende rolle i styringen af molekylær transport og rekruttering af immunceller37,38. Inkluderingen af patientafledte immunceller kan være afgørende for modellering af tarmsygdomme, da det giver mulighed for at påvise samspillet mellem medfødt og adaptiv immunitet samt etablering af vævsspecifik immunitet39. Efter færdiggørelsen af 3D-morfogenese på Gut-on-a-Chip kan organoidkulturmediet modificeres til et organoiddifferentieringsmedium. Dette kan være en levedygtig tilgang til at fremkalde yderligere cellulær differentiering, afhængigt af de eksperimentelle mål.
Billeddannelse af 3D-mikroarkitekturen in situ er udfordrende på grund af den lange arbejdsafstand, der kræves, hvilket kan overvindes med et langdistancemål. Derudover gør lag-for-lag mikrofabrikations- og limningsmetoderne det vanskeligt at få adgang til øverste lag til undersøgelse med SEM. Til det nuværende Gut-on-a-Chip-design er der brug for en sprøjtepumpe pr. Gut-on-a-Chip-mikroenhed, der optager CO2 -inkubatorplads og forhindrer store eksperimenter. Der er behov for innovationer for at øge skalerbarheden for en brugervenlig platform og screening med høj kapacitet.
Disse nuværende protokoller giver mulighed for spontan udvikling af 3D-epitellag in vitro, hvilket overgår begrænsningerne ved traditionelle 3D-organoider, 2D-monolag og statiske mikroenhedskultursystemer. Dette dynamiske in vitro intestinale mikromiljø kan styres ved at indføre samkultur af forskellige celletyper. Tidligere undersøgelser har undersøgt metoder til manipulation af Gut-on-a-Chip-mikromiljøet, herunder co-kultivering af tarmmikrobiomet14,23 og perifere mononukleære celler30. Dette rekonstituerede mikromiljø har adskillige potentielle anvendelser, herunder lægemiddeltestning, grundlæggende mekanistiske undersøgelser og sygdomsmodellering. Det rekonstruerede mikromiljø har et betydeligt potentiale for en bred vifte af applikationer, såsom lægemiddeltest 23,40,41 og sygdomsmodellering 12,13,14,30 samt grundlæggende mekanistiske undersøgelser af intestinal morfogenese 42. En række assays kan udføres enten ved at indsamle supernatanter til vurdering af metabolitter 43, ved at indsamle celler til genomundersøgelse 2,32 eller ved visuelt at undersøge cellerne ved hjælp af levende cellefarvestoffer eller fiksering med henblik på efterfølgende immunfluorescensbilleddannelse 23,44.
Denne undersøgelse præsenterer en reproducerbar protokol til udvikling af 3D-morfogenese af hundens intestinale epitellag i en Gut-on-a-Chip-platform. Den resulterende 3D-epitelstruktur giver en mere realistisk repræsentation af tarmmikromiljøet, som har et enormt potentiale for anvendelser i forskellige biomedicinske undersøgelser. Ved at udnytte denne tarmarkitektur kan vi udføre mere translationel forskning og potentielt give lovende resultater.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke WSU Small Animal Internal Medicine service (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) og WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss for deres støtte i tilfælde rekruttering og prøveindsamling fra borgerforskere (patientdonorer). Dette arbejde blev delvist støttet af Office of The Director, National Institutes Of Health (K01OD030515 and R21OD031903 to Y.M.A.) og Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 til I.N.). Figur 1A og figur 3A blev oprettet med BioRender.com.
Organoid basal medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
Organoids and organoid medium | |||
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
[Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Reagents | |||
4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
Materials and Equipment | |||
24-well culture plates | Corning | 3524 | |
87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica microsystems |