Micro-injectie van recombinant RCAS(A)-retrovirus in embryonale kippenlens
Summary
Dit protocoldocument beschrijft de methodologie van embryonale micro-injectie van een RCAS(A)-retrovirus met kippenlenzen als een hulpmiddel voor het bestuderen van de in situ functie en expressie van eiwitten tijdens de ontwikkeling van lenzen.
Abstract
Embryonale kip (Gallus domesticus) is een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie, gezien de hoge mate van gelijkenis met de menselijke lens. RCAS(A) is een replicatiecompetent kippenretrovirus dat delende cellen infecteert, wat dient als een krachtig hulpmiddel om de in situ expressie en functie van wildtype en mutante eiwitten tijdens de ontwikkeling van de lens te bestuderen door micro-injectie in het lege lumen van het lensblaasje di vroege ontwikkelingsstadia, waardoor de werking ervan wordt beperkt tot de omliggende prolifererende lenscellen. Vergeleken met andere benaderingen, zoals transgene modellen en ex vivo culturen, biedt het gebruik van een RCAS(A)-replicatiecompetent aviair retrovirus een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten in kuikenembryo’s tot expressie te brengen. In het bijzonder kan gerichte genoverdracht worden beperkt tot proliferatieve lensvezelcellen zonder dat er weefselspecifieke promotors nodig zijn. In dit artikel geven we een kort overzicht van de stappen die nodig zijn voor de bereiding van recombinant retrovirus RCAS(A), geven we een gedetailleerd, uitgebreid overzicht van de micro-injectieprocedure en geven we voorbeeldresultaten van de techniek.
Introduction
Het doel van dit protocol is het beschrijven van de methodologie van embryonale micro-injectie met kippenlenzen van een RCAS(A) (replicatiecompetent aviair sarcoom/leukose retrovirus A). Effectieve retrovirale toediening in een embryonale kippenlens is een veelbelovend hulpmiddel gebleken voor de in vivo studie van het moleculaire mechanisme en de structuur-functie van lenseiwitten in de fysiologie, pathologische omstandigheden en ontwikkeling van normale lenzen. Bovendien zou dit experimentele model kunnen worden gebruikt voor de identificatie van therapeutische doelwitten en het screenen van geneesmiddelen voor aandoeningen zoals aangeboren staar bij de mens. Al met al is dit protocol bedoeld om de nodige stappen uit te stippelen voor de ontwikkeling van een aanpasbaar platform voor de studie van lenseiwitten.
Embryonale kuikens (Gallus domesticus) zijn, vanwege hun gelijkenis in lensstructuur en functie met de menselijke lens, een gerenommeerd diermodel voor de studie van lensontwikkeling en fysiologie 1,2,3,4. Het gebruik van een RCAS(A)-replicatiecompetent aviair retrovirus wordt beschouwd als een zeer effectief, snel en aanpasbaar systeem om exogene eiwitten tot expressie te brengen in kuikenembryo’s. Het heeft met name een uniek vermogen om de doelgenoverdracht te beperken tot proliferatieve lensvezelcellen zonder de noodzaak van weefselspecifieke promotors, gebruikmakend van het unieke embryonale ontwikkelingstijdsbestek waarin de aanwezigheid van leeg lenslumen in situ RCAS(A)-micro-injectie in de beperkte plaats mogelijk maakt voor de expressie van exogene eiwitten di proliferatieve lensvezelcellen5, 6,7,8.
De micro-injectieprocedure voor kuikenembryo’s, die hier uitgebreid wordt beschreven, is oorspronkelijk gedeeltelijk gebaseerd op het werk van Fekete et. al.6 en verder ontwikkeld door Jiang et. al.8 en is gebruikt als een middel om zowel virale als niet-virale plasmiden in de lens van embryonale kuikens te introduceren 1,9,10,11,12,13. Over het algemeen toont het eerdere werk het potentieel aan van het gebruik van deze methodologie om de ontwikkeling, differentiatie, cellulaire communicatie en ziekteprogressie van lenzen te bestuderen, en voor het ontdekken en testen van therapeutische doelen voor lenspathologische aandoeningen zoals staar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit experimentele model biedt de mogelijkheid om het eiwit of de eiwitten van belang tot expressie te brengen in de intacte lens, wat leidt tot de studie van de functionele relevantie van deze eiwitten in de structuur en functie van de lens. Het embryonale kuiken-micro-injectiemodel is gedeeltelijk gebaseerd op het werk van Fekete et. al.6 en werd verder ontwikkeld door Jiang et. al.8 en is gebruikt als een middel om zowel virale plasmiden als middelen zoals agonisten, klei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (aan J.X.J) en F32DK134051 (aan FMA), en Welch Foundation grant: AQ-1507 (aan J.X.J.). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. De figuren zijn gedeeltelijk gemaakt met Biorender.com.
Materials
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | – | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | – | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | – | – | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | – | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
Riferimenti
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
- Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
- Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
- McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
- Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
- Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
- Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
- Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
- Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
- Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965 (2023).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
- Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
- Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
- Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060 (2022).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
- Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
- Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Biologia dello sviluppo. 103 (1), 129-141 (1984).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).
- Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
- Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
- West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
- Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501 (2023).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
- Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
- Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).
