Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo
Summary
Questo documento di protocollo descrive la metodologia della microiniezione embrionale di lenti di pollo di un retrovirus RCAS(A) come strumento per studiare la funzione in situ e l’espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente.
Abstract
Il pollo embrionale (Gallus domesticus) è un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino, dato il suo alto grado di somiglianza con il cristallino umano. RCAS(A) è un retrovirus di pollo competente per la replicazione che infetta le cellule in divisione, che funge da potente strumento per studiare l’espressione e la funzione in situ di proteine wild-type e mutanti durante lo sviluppo del cristallino mediante microiniezione nel lume vuoto della vescicola del cristallino nelle prime fasi di sviluppo, limitando la sua azione alle cellule del cristallino proliferanti circostanti. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo , l’uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, il trasferimento genico mirato può essere confinato alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici. In questo articolo, forniremo una breve panoramica dei passaggi necessari per la preparazione del retrovirus ricombinante RCAS(A), forniremo una panoramica dettagliata e completa della procedura di microiniezione e forniremo i risultati di esempio della tecnica.
Introduction
L’obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la metodologia di microiniezione embrionale di lenti di pollo di un RCAS(A) (sarcoma/leucosi retrovirale A competente per la replicazione). È stato dimostrato che l’efficace somministrazione retrovirale in una lente embrionale di pollo è uno strumento promettente per lo studio in vivo del meccanismo molecolare e della struttura-funzione delle proteine della lente nella normale fisiologia del cristallino, nelle condizioni patologiche e nello sviluppo. Inoltre, questo modello sperimentale potrebbe essere utilizzato per l’identificazione di bersagli terapeutici e lo screening farmacologico per condizioni come la cataratta congenita umana. Nel complesso, questo protocollo mira a delineare i passi necessari per lo sviluppo di una piattaforma personalizzabile per lo studio delle proteine del cristallino.
I pulcini embrionali (Gallus domesticus), a causa della loro somiglianza nella struttura e nella funzione del cristallino con il cristallino umano, sono un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino 1,2,3,4. L’uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione è stato considerato un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, ha una capacità unica di confinare il trasferimento genico bersaglio alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici, utilizzando l’esclusivo lasso di tempo di sviluppo embrionale in cui la presenza di lume del cristallino vuoto consente la microiniezione in situ di RCAS(A) nel sito ristretto per l’espressione di proteine esogene all’interno delle cellule proliferative della fibra del cristallino5, 6,7,8.
La procedura di microiniezione dell’embrione di pulcino, qui descritta in modo approfondito, si basa originariamente in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 e ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per introdurre plasmidi virali e non virali nel cristallino dei pulcini embrionali 1,9,10,11,12,13. Nel complesso, il lavoro precedente dimostra il potenziale dell’utilizzo di questa metodologia per studiare lo sviluppo del cristallino, la differenziazione, la comunicazione cellulare e la progressione della malattia, e per la scoperta e il test di bersagli terapeutici per condizioni patologiche del cristallino come la cataratta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo modello sperimentale offre l’opportunità di esprimere la/e proteina/e di interesse nel cristallino intatto, portando allo studio della rilevanza funzionale di queste proteine nella struttura e nella funzione del cristallino. Il modello di microiniezione del pulcino embrionale si basa in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 ed è stato ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per inserire sia plasmidi virali che agenti come agonisti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) e F32DK134051 (a FMA) e dalla sovvenzione della Welch Foundation: AQ-1507 (a J.X.J.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.
Materials
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | – | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | – | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | – | – | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | – | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
Riferimenti
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