Microinjeção de Retrovírus RCAS(A) Recombinante em Lentes de Galinha Embrionárias
Summary
Este trabalho de protocolo descreve a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um retrovírus RCAS(A) como uma ferramenta para estudar a função in situ e a expressão de proteínas durante o desenvolvimento do cristalino.
Abstract
A galinha embrionária (Gallus domesticus) é um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino, dado o seu alto grau de similaridade com o cristalino humano. RCAS(A) é um retrovírus de galinha competente em replicação que infecta células em divisão, que serve como uma ferramenta poderosa para estudar a expressão in situ e a função de proteínas selvagens e mutantes durante o desenvolvimento do cristalino por microinjeção no lúmen vazio da vesícula do cristalino nos estágios iniciais de desenvolvimento, restringindo sua ação às células do cristalino em proliferação circundantes. Em comparação com outras abordagens, como modelos transgênicos e culturas ex vivo , o uso de um retrovírus aviário competente em replicação RCAS(A) fornece um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Especificamente, a transferência gênica direcionada pode ser confinada a células de fibras proliferativas do cristalino sem a necessidade de promotores tecido-específicos. Neste artigo, faremos uma breve visão geral das etapas necessárias para a preparação de RCAS(A) de retrovírus recombinante, forneceremos uma visão geral detalhada e abrangente do procedimento de microinjeção e forneceremos resultados de amostra da técnica.
Introduction
O objetivo deste protocolo é descrever a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um RCAS(A) (replication-competente avian sarcoma/leukosis retrovirus A). A liberação retroviral efetiva em uma lente de frango embrionária tem se mostrado uma ferramenta promissora para o estudo in vivo do mecanismo molecular e da função-estrutura das proteínas do cristalino na fisiologia normal do cristalino, condições patológicas e desenvolvimento. Além disso, esse modelo experimental poderia ser utilizado para a identificação de alvos terapêuticos e triagem medicamentosa para condições como catarata congênita humana. Ao todo, esse protocolo visa estabelecer as etapas necessárias para o desenvolvimento de uma plataforma customizável para o estudo das proteínas do cristalino.
Pintos embrionários (Gallus domesticus), devido à sua semelhança na estrutura e função do cristalino com o cristalino humano, são um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino 1,2,3,4. O uso de um retrovírus aviário com competência em replicação RCAS(A) tem sido considerado um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Notavelmente, ele tem uma capacidade única de confinar a transferência do gene alvo às células de fibra do cristalino proliferativo sem a necessidade de promotores tecido-específicos, usando o período de tempo de desenvolvimento embrionário único no qual a presença de lúmen vazio do cristalino permite a microinjeção in situ de RCAS(A) no local restrito para a expressão de proteínas exógenas dentro de células de fibras proliferativas do cristalino5, 6,7,8.
O procedimento de microinjeção de embrião de pintinho, descrito em profundidade aqui, é originalmente parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de introdução de plasmídeos virais e não virais no cristalino de pintos embrionários 1,9,10,11,12,13. Em geral, o trabalho anterior demonstra o potencial da utilização desta metodologia para estudar o desenvolvimento do cristalino, diferenciação, comunicação celular e progressão da doença, e para a descoberta e teste de alvos terapêuticos para condições patológicas do cristalino, como catarata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este modelo experimental oferece a oportunidade de expressar a(s) proteína(s) de interesse no cristalino intacto, levando ao estudo da relevância funcional dessas proteínas na estrutura e função do cristalino. O modelo de microinjeção de pintinhos embrionários é parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e foi desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de inserção de plasmídeos virais e agentes como agonistas, pequenos RNAs interfere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (para J.X.J) e F32DK134051 (para F.M.A), e concessão da Fundação Welch: AQ-1507 (para J.X.J.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.
Materials
| 0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
| 35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
| Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
| Constructs | GENEWIZ | – | For generation of constructs |
| Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
| DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | – | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
| Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
| Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
| Egg Holder | – | – | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
| Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
| Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
| Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
| Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
| Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
| Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
| Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
| Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
| Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
| Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
| rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | – | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
| rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
| Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
| Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
Riferimenti
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