Detta protokoll beskriver metodiken för embryonal mikroinjektion av ett RCAS(A)-retrovirus som ett verktyg för att studera in situ-funktion och uttryck av proteiner under linsutveckling.
Embryonal kyckling (Gallus domesticus) är en väletablerad djurmodell för studier av linsutveckling och fysiologi, med tanke på dess höga grad av likhet med den mänskliga linsen. RCAS(A) är ett replikationskompetent kycklingretrovirus som infekterar celler som delar sig, vilket fungerar som ett kraftfullt verktyg för att studera in situ-uttrycket och funktionen hos vildtypsproteiner och muterade proteiner under linsutveckling genom mikroinjektion i linsvesikelns tomma lumen i tidiga utvecklingsstadier, vilket begränsar dess verkan till omgivande prolifererande linsceller. Jämfört med andra metoder, såsom transgena modeller och ex vivo-odlingar , ger användningen av ett RCAS(A)-replikationskompetent aviärt retrovirus ett mycket effektivt, snabbt och anpassningsbart system för att uttrycka exogena proteiner i kycklingembryon. Specifikt kan riktad genöverföring begränsas till proliferativa linsfiberceller utan behov av vävnadsspecifika promotorer. I den här artikeln kommer vi kortfattat att översiktera de steg som behövs för beredning av rekombinant retrovirus RCAS(A), ge en detaljerad, omfattande översikt över mikroinjektionsproceduren och ge provresultat av tekniken.
Målet med detta protokoll är att beskriva metodiken för mikroinjektion av en RCAS(A) (replikationskompetent aviär sarkom/leukosretrovirus A). Effektiv retroviral tillförsel i en embryonal kycklinglins har visat sig vara ett lovande verktyg för in vivo-studier av den molekylära mekanismen och struktur-funktionen hos linsproteiner vid normal linsfysiologi, patologiska tillstånd och utveckling. Dessutom skulle denna experimentella modell kunna användas för identifiering av terapeutiska mål och läkemedelsscreening för tillstånd som medfödd grå starr hos människor. Sammantaget syftar detta protokoll till att fastställa de nödvändiga stegen för utvecklingen av en anpassningsbar plattform för studier av linsproteiner.
Embryonala kycklingar (Gallus domesticus) är, på grund av sin likhet i linsstruktur och funktion med den mänskliga linsen, en väletablerad djurmodell för studier av linsutveckling och fysiologi 1,2,3,4. Användningen av ett RCAS(A)-replikationskompetent aviärt retrovirus har betraktats som ett mycket effektivt, snabbt och anpassningsbart system för att uttrycka exogena proteiner i kycklingembryon. Noterbart är att den har en unik förmåga att begränsa målgenöverföringen till proliferativa linsfiberceller utan behov av vävnadsspecifika promotorer, med hjälp av den unika embryonala utvecklingstidsramen under vilken närvaron av tom linslumen tillåter in situ RCAS(A)-mikroinjektion på det begränsade stället för uttryck av exogena proteiner inom proliferativa linsfiberceller5, 6,7,8.
Mikroinjektionsproceduren för kycklingembryon, som beskrivs ingående här, är ursprungligen delvis baserad på Fekete et:s arbete. al.6 och vidareutvecklades av Jiang et. al.8 och har använts som ett sätt att introducera både virala och icke-virala plasmider i linsen hos embryonala kycklingar 1,9,10,11,12,13. Sammantaget visar det tidigare arbetet potentialen i att använda denna metodik för att studera linsutveckling, differentiering, cellulär kommunikation och sjukdomsprogression, och för upptäckt och testning av terapeutiska mål för linspatologiska tillstånd som grå starr.
Denna experimentella modell ger möjlighet att uttrycka protein(er) av intresse i den intakta linsen, vilket leder till studier av den funktionella relevansen av dessa proteiner i linsens struktur och funktion. Mikroinjektionsmodellen för embryonala kycklingar är delvis baserad på Fekete et:s arbete. al.6 och vidareutvecklades av Jiang et. al.8 och har använts som ett sätt att föra in både virala plasmider och medel såsom agonister, små störande RNA (siRNA) och pe…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (till J.X.J) och F32DK134051 (till F.M.A), och Welch Foundation-bidrag: AQ-1507 (till J.X.J.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter. Figurerna skapades delvis med Biorender.com.
0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
Constructs | GENEWIZ | – | For generation of constructs |
Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | – | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
Egg Holder | – | – | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | – | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |