مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة
Summary
يصف هذا البروتوكول ويقارن طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا انسجة اللحمة المتوسطة (MSCs). تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل وتشغيل أبسط وتمايز عظمي أسهل. تتميز طريقة الأجسام الجنينية (EBs) باستهلاك أقل للوقت.
Abstract
الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات تستخدم على نطاق واسع في الطب التجديدي. نظرا لأن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية مقيدة بالتبرع المحدود واختلافات الجودة والسلامة البيولوجية ، فقد شهدت السنوات ال 10 الماضية ارتفاعا كبيرا في الجهود المبذولة لتوليد MSCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تركزت الجهود السابقة والحديثة في تمايز hiPSCs إلى MSCs حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافة أحادية الطبقة. يصف هذا البروتوكول هاتين الطريقتين التمثيليتين في اشتقاق MSC من hiPSCs. تقدم كل طريقة مزاياها وعيوبها ، بما في ذلك الوقت والتكلفة والقدرة على تكاثر الخلايا والتعبير عن علامات MSC وقدرتها على التمايز في المختبر. يوضح هذا البروتوكول أن كلتا الطريقتين يمكن أن تشتق MSCs ناضجة ووظيفية من hiPSCs. تتميز طريقة الطبقة الأحادية بتكلفة أقل ، وتشغيل أبسط ، وتمايز عظمي أسهل ، بينما تتميز طريقة EB باستهلاك أقل للوقت.
Introduction
الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي خلايا جذعية بالغة متعددة القدرات مشتقة من الأديم المتوسط1. MSCs موجودة في جميع الأنسجة الضامة تقريبا2. منذ اكتشاف MSCs لأول مرة في سبعينيات القرن العشرين وعزلها بنجاح من نخاع العظام في عام 1987 من قبل Friedenstein et al.3،4،5 ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة الجسدية البشرية (بما في ذلك الجنين والبالغين) لعزل MSCs مثل العظام والغضاريف والأوتار والعضلات والأنسجة الدهنية ، والسدى الداعم للدم1،2،6،7. تظهر MSCs قدرات تكاثرية عالية ومرونة للتمايز إلى العديد من سلالات الخلايا الجسدية ويمكن أن تهاجر إلى الأنسجة المصابة والملتهبة2،8،9. هذه الخصائص تجعل MSCs مرشحا محتملا للطب التجديدي10. ومع ذلك ، فإن MSCs المشتقة من الأنسجة الجسدية (st-MSCs) مقيدة بالتبرع المحدود ، والقدرة المحدودة على تكاثر الخلايا ، واختلافات الجودة ، ومخاوف السلامة البيولوجية للانتقال المحتمل لمسببات الأمراض ، إن وجدت ، من المتبرعين11،12.
تستمد الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) من إعادة برمجة الخلايا البالغة بعوامل النسخ (Oct4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc) ، والتي لها وظائف مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية13,14. يمكنهم التجديد الذاتي وامتلاك إمكانية التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، بما في ذلك MSCs. بالمقارنة مع st-MSCs ، تتمتع iPSC-MSCs بميزة العرض غير المحدود ، والتكلفة المنخفضة ، والنقاء العالي ، والراحة في مراقبة الجودة ، وسهولة الإنتاج على نطاق واسع وتعديل الجينات15،16،17.
نظرا لهذه المزايا ل iPSC-MSCs ، تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الطرق التي تقود MSC من iPSC. تركزت طرق التمايز هذه حول منهجيتين للاستزراع: (1) تكوين الأجسام الجنينية (EBs) و (2) استخدام الثقافات أحادية الطبقة11،18،19،20. وهنا تم تحديد نهج تمثيلي لكل من المنهجيتين. علاوة على ذلك ، تم أيضا الوصول إلى مقارنات بين نهجين تمثيليين على أساس الوقت والتكلفة والقدرة على التكاثر والتعبير عن المؤشرات الحيوية MSC والقدرة على التمايز في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، تم فحص طريقتين تمثيليتين للتمييز بين hiPSCs إلى MSCs20،21،22،23،24،25،26،27،28،30. كانت كلتا الط?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للغاية لجميع أعضاء مختبر ماو وهيو ، في الماضي والحاضر ، على المناقشات الشيقة والمساهمات العظيمة في المشروع. نحن ممتنون للمركز الوطني للبحوث السريرية لصحة الطفل على الدعم الكبير. تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U20A20351 إلى جيانهوا ماو ، 82200784 إلى ليدان هو) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ الصينية (No. LQ22C070004 إلى ليدان هو).
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
Riferimenti
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus – Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
