Vergelijking van twee representatieve methoden voor differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in mesenchymale stromale cellen
Summary
Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC’s in mesenchymale stromale cellen (MSC’s). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB’s) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.
Abstract
Mesenchymale stromale cellen (MSC’s) zijn volwassen pluripotente stamcellen die op grote schaal worden gebruikt in de regeneratieve geneeskunde. Aangezien somatische weefsel-afgeleide MSC’s worden beperkt door beperkte donatie, kwaliteitsvariaties en bioveiligheid, is er de afgelopen 10 jaar een grote toename geweest in de inspanningen om MSC’s te genereren uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s). Eerdere en recente inspanningen in de differentiatie van hiPSC’s in MSC’s waren gecentreerd rond twee kweekmethodologieën: (1) de vorming van embryoïde lichamen (EB’s) en (2) het gebruik van monolaagcultuur. Dit protocol beschrijft deze twee representatieve methoden voor het afleiden van MSC uit hiPSC’s. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen, waaronder tijd, kosten, celproliferatievermogen, de expressie van MSC-markers en hun vermogen tot differentiatie in vitro. Dit protocol toont aan dat beide methoden volwassen en functionele MSC’s kunnen afleiden uit hiPSC’s. De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie, terwijl de EB-methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.
Introduction
Mesenchymale stromale cellen (MSC’s) zijn van mesoderm afgeleide volwassen pluripotentestamcellen1. MSC’s zijn aanwezig in bijna alle bindweefsels2. Sinds MSC’s voor het eerst werden ontdekt in de jaren 1970 en met succes werden geïsoleerd uit het beenmerg in 1987 door Friedenstein et al.3,4,5, is een verscheidenheid aan menselijke somatische (inclusief foetale en volwassen) weefsels gebruikt voor het isoleren van MSC’s zoals bot, kraakbeen, pezen, spieren, vetweefsel en hematopoëtisch ondersteunend stroma 1,2,6,7 . MSC’s vertonen een hoog proliferatief vermogen en plasticiteit om te differentiëren in vele somatische cellijnen en kunnen migreren naar beschadigde en ontstoken weefsels 2,8,9. Deze eigenschappen maken MSC’s een potentiële kandidaat voor regeneratieve geneeskunde10. Van somatisch weefsel afgeleide MSC’s (st-MSC’s) worden echter beperkt door beperkte donatie, beperkte celproliferatieve capaciteit, kwaliteitsvariaties en bezorgdheid over de bioveiligheid voor mogelijke overdracht van pathogenen, indien aanwezig, van de donoren 11,12.
Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) zijn afgeleid van volwassen cellen die herprogrammeren met transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc), die vergelijkbare functies hebben als embryonale stamcellen13,14. Ze kunnen zichzelf vernieuwen en hebben het potentieel om te differentiëren in elk type somatische cellen, inclusief MSC’s. Vergeleken met st-MSC’s hebben iPSC-MSC’s het voordeel van onbeperkte levering, lagere kosten, hogere zuiverheid, gemak bij kwaliteitscontrole, gemakkelijk voor schaalproductie en genmodificatie 15,16,17.
Vanwege deze voordelen van iPSC-MSC’s zijn er verschillende methoden gerapporteerd die MSC vanuit iPSC aansturen. Deze differentiatiemethoden zijn gecentreerd rond twee kweekmethoden: (1) de vorming van embryoïde lichamen (EB’s) en (2) het gebruik van monolaagculturen 11,18,19,20. Hierin werd een representatieve benadering voor elk van de twee methodologieën gekenmerkt. Verder werd ook gebruik gemaakt van vergelijkingen tussen twee representatieve benaderingen op basis van tijd, kosten, proliferatievermogen, expressie van MSC-biomarkers en differentiatievermogen in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol werden twee representatieve methoden onderzocht om hiPSC’s te differentiëren in MSC’s: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Beide methoden waren in staat om MSC’s af te leiden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn alle leden van het Mao en Hu Lab, vroeger en nu, enorm dankbaar voor de interessante discussies en geweldige bijdragen aan het project. We zijn het National Clinical Research Center for Child Health dankbaar voor de geweldige steun. Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U20A20351 aan Jianhua Mao, 82200784 aan Lidan Hu), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang in China (nr. LQ22C070004 naar Lidan Hu).
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
Riferimenti
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus – Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
