मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए दो प्रतिनिधि तरीकों की तुलना
Summary
यह प्रोटोकॉल mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) में hiPSCs अंतर के लिए दो प्रतिनिधि तरीकों का वर्णन करता है और तुलना करता है. मोनोलेयर विधि को कम लागत, सरल संचालन और आसान ओस्टोजेनिक भेदभाव की विशेषता है। भ्रूण निकायों (ईबी) विधि को कम समय की खपत की विशेषता है।
Abstract
मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं (एमएससी) वयस्क प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल हैं जिनका पुनर्योजी चिकित्सा में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। चूंकि दैहिक ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी सीमित दान, गुणवत्ता भिन्नताओं और जैव सुरक्षा द्वारा प्रतिबंधित हैं, पिछले 10 वर्षों में मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से एमएससी उत्पन्न करने के प्रयासों में काफी वृद्धि देखी गई है। एमएससी में एचआईपीएससी के भेदभाव में पिछले और हाल के प्रयास दो संस्कृति पद्धतियों के आसपास केंद्रित हैं: (1) भ्रूण निकायों (ईबी) का गठन और (2) मोनोलेयर संस्कृति का उपयोग। यह प्रोटोकॉल hiPSCs से MSC प्राप्त करने में इन दो प्रतिनिधि तरीकों का वर्णन करता है। प्रत्येक विधि अपने फायदे और नुकसान प्रस्तुत करती है, जिसमें समय, लागत, सेल प्रसार क्षमता, एमएससी मार्करों की अभिव्यक्ति और इन विट्रो में भेदभाव की उनकी क्षमता शामिल है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि दोनों विधियां एचआईपीएससी से परिपक्व और कार्यात्मक एमएससी प्राप्त कर सकती हैं। मोनोलेयर विधि को कम लागत, सरल संचालन और आसान ओस्टोजेनिक भेदभाव की विशेषता है, जबकि ईबी विधि को कम समय की खपत की विशेषता है।
Introduction
मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं (एमएससी) मेसोडर्म-व्युत्पन्न वयस्क प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल1 हैं। एमएससी लगभग सभी संयोजी ऊतकों में मौजूद हैं2. चूंकि MSCs को पहली बार 1970 के दशक में खोजा गया था और 1987 में फ्राइडेनस्टीन एट अल 3,4,5 द्वारा अस्थि मज्जा से सफलतापूर्वक अलग किया गया था, इसलिए विभिन्न प्रकार के मानव दैहिक (भ्रूण और वयस्क सहित) ऊतकों का उपयोग एमएससी जैसे हड्डी, उपास्थि, कण्डरा, मांसपेशियों, वसा ऊतक, और हेमटोपोइएटिक-सहायक स्ट्रोमा 1,2,6,7 को अलग करने के लिए किया गया है. एमएससी कई दैहिक सेल वंशावली में अंतर करने के लिए उच्च प्रोलिफेरेटिव क्षमताओं और प्लास्टिसिटी का प्रदर्शन करते हैं और घायल और सूजन वाले ऊतकों 2,8,9 में पलायन कर सकते हैं। ये गुण एमएससी को पुनर्योजी चिकित्सा10 के लिए एक संभावित उम्मीदवार बनाते हैं। हालांकि, दैहिक ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी (एसटी-एमएससी) सीमित दान, सीमित सेल प्रोलिफेरेटिव क्षमता, गुणवत्ता भिन्नताओं, और रोगजनकों के संभावित संचरण के लिए जैव सुरक्षा चिंता, यदि कोई हो, दाताओं11,12 से प्रतिबंधित हैं।
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSCs) प्रतिलेखन कारकों (Oct4, Sox2, Klf4, और c-Myc) के साथ वयस्क कोशिकाओं reprogramming से ली गई है, जो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं13,14 के रूप में समान कार्य है. वे आत्म-नवीनीकरण कर सकते हैं और एमएससी सहित किसी भी प्रकार की दैहिक कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता रखते हैं। एसटी-एमएससी की तुलना में, आईपीएससी-एमएससी में असीमित आपूर्ति, कम लागत, उच्च शुद्धता, गुणवत्ता नियंत्रण में सुविधा, पैमाने पर उत्पादन और जीन संशोधन 15,16,17 के लिए आसान का लाभ है।
IPSC-MSCs के इन फायदों के कारण, IPSC से MSC ड्राइविंग तरीकों की एक किस्म की सूचना दी गई है. इन भेदभाव विधियों को दो संस्कृति पद्धतियों के आसपास केंद्रित किया गया है: (1) भ्रूण निकायों (ईबी) का गठन और (2) मोनोलेयर संस्कृतियों का उपयोग 11,18,19,20. इसमें, दो पद्धतियों में से प्रत्येक के लिए एक प्रतिनिधि दृष्टिकोण की विशेषता थी। इसके अलावा, समय, लागत, प्रोलिफेरेटिव क्षमता, एमएससी बायोमार्कर की अभिव्यक्ति और इन विट्रो में भेदभाव क्षमता के आधार पर दो प्रतिनिधि दृष्टिकोणों के बीच तुलना भी एक्सेस की गई थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, एमएससी में एचआईपीएससी को अलग करने के दो प्रतिनिधि तरीकों की जांच 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30 की गई।…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम दिलचस्प चर्चाओं और परियोजना में महान योगदान के लिए माओ और हू लैब के सभी सदस्यों, अतीत और वर्तमान के लिए बहुत आभारी हैं। हम महान समर्थन के लिए बाल स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय नैदानिक अनुसंधान केंद्र के आभारी हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (जियानहुआ माओ के U20A20351, लिदान हू के 82200784), चीन के झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं। LQ22C070004 लिडान हू को)।
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
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