Сравнение двух репрезентативных методов дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стромальные клетки
Summary
Этот протокол описывает и сравнивает два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой. Метод эмбриоидных телец (ЭБ) характеризуется меньшими затратами времени.
Abstract
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – это взрослые плюрипотентные стволовые клетки, которые широко используются в регенеративной медицине. Поскольку МСК, полученные из соматических тканей, ограничены ограниченным донорством, вариациями качества и биобезопасностью, в последние 10 лет наблюдается значительный рост усилий по получению МСК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Прошлые и недавние усилия по дифференцировке ИПСК в МСК были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (ЭБ) и (2) использование монослойной культуры. В этом протоколе описаны эти два репрезентативных метода получения МСК из ИПСК. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, включая время, стоимость, способность клеток к пролиферации, экспрессию маркеров МСК и их способность к дифференцировке in vitro. Этот протокол демонстрирует, что оба метода могут извлекать зрелые и функциональные МСК из ИПСК. Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой, в то время как метод EB характеризуется меньшими затратами времени.
Introduction
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой взрослые плюрипотентные стволовые клетки, полученные из мезодермы1. МСК присутствуют практически во всех соединительных тканях2. С тех пор, как МСК были впервые обнаружены в 1970-х годах и успешно выделены из костного мозга в 1987 году Friedenstein et al.3,4,5, для выделения МСК использовались различные соматические ткани человека (включая эмбриональные и взрослые), такие как кости, хрящи, сухожилия, мышцы, жировая ткань и поддерживающая кроветворение строма 1,2,6,7 . МСК демонстрируют высокую пролиферативную способность и пластичность дифференцироваться во многие линии соматических клеток и могут мигрировать в поврежденные и воспаленные ткани 2,8,9. Эти свойства делают МСК потенциальным кандидатом для регенеративной медицины10. Тем не менее, МСК, полученные из соматической ткани (st-МСК), ограничены ограниченным донорством, ограниченной способностью клеток к пролиферации, вариациями качества и опасениями по поводу биобезопасности в отношении возможной передачи патогенов, если таковые имеются, от доноров11,12.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) получают из взрослых клеток, перепрограммированных транскрипционными факторами (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc), которые выполняют те же функции, что и эмбриональные стволовые клетки13,14. Они могут самообновляться и обладают потенциалом дифференцировки в любой тип соматических клеток, включая МСК. По сравнению с st-МСК, ИПСК-МСК имеет преимущество неограниченного предложения, более низкой стоимости, более высокой чистоты, удобства в контроле качества, простоты масштабирования производства и модификации генов 15,16,17.
В связи с этими преимуществами ИПСК-МСК сообщалось о различных методах, приводящих к получению МСК из ИПСК. Эти методы дифференциации были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (БЭ) и (2) использование монослойных культур 11,18,19,20. В данной работе был охарактеризован репрезентативный подход для каждой из двух методологий. Кроме того, были проведены сравнения между двумя репрезентативными подходами, основанными на времени, стоимости, пролиферативной способности, экспрессии биомаркеров МСК и способности к дифференцировке in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном протоколе были рассмотрены два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в МСК 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30.<sup class=…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Мы благодарны Национальному клиническому исследовательскому центру детского здоровья за огромную поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху).
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
Riferimenti
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus – Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
