Jämförelse av två representativa metoder för differentiering av humana inducerade pluripotenta stamceller till mesenkymala stromaceller
Summary
Detta protokoll beskriver och jämför två representativa metoder för att differentiera hiPSCs till mesenkymala stromaceller (MSC). Monolagermetoden kännetecknas av lägre kostnad, enklare drift och enklare osteogen differentiering. Metoden med embryoidkroppar (EB) kännetecknas av lägre tidsåtgång.
Abstract
Mesenkymala stromaceller (MSC) är vuxna pluripotenta stamceller som har använts i stor utsträckning inom regenerativ medicin. Eftersom somatiska vävnadshärledda MSC begränsas av begränsad donation, kvalitetsvariationer och biosäkerhet, har de senaste 10 åren sett en stor ökning av ansträngningarna att generera MSC från humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs). Tidigare och senare ansträngningar för att differentiera hiPSCs till MSC har centrerats kring två odlingsmetoder: (1) bildandet av embryoidkroppar (EB) och (2) användningen av monolayer-odling. Detta protokoll beskriver dessa två representativa metoder för att härleda MSC från hiPSC. Varje metod har sina fördelar och nackdelar, inklusive tid, kostnad, cellproliferationsförmåga, uttrycket av MSC-markörer och deras förmåga till differentiering in vitro. Detta protokoll visar att båda metoderna kan härleda mogna och funktionella MSC:er från hiPSCs. Monolayer-metoden kännetecknas av lägre kostnad, enklare drift och enklare osteogen differentiering, medan EB-metoden kännetecknas av lägre tidsåtgång.
Introduction
Mesenkymala stromaceller (MSC) är pluripotenta stamceller från vuxna som härstammar från mesoderm1. MSC finns i nästan all bindväv2. Sedan MSC först upptäcktes på 1970-talet och framgångsrikt isolerades från benmärg 1987 av Friedenstein et al.3,4,5, har en mängd olika mänskliga somatiska (inklusive foster och vuxna) vävnader använts för att isolera MSC såsom ben, brosk, senor, muskler, fettvävnad och hematopoetiskt stödjande stroma 1,2,6,7 . MSC uppvisar hög proliferativ förmåga och plasticitet att differentiera till många somatiska cellinjer och kan migrera till skadade och inflammerade vävnader 2,8,9. Dessa egenskaper gör MSC till en potentiell kandidat för regenerativ medicin10. Somatiska vävnadsderiverade MSC (st-MSC) begränsas dock av begränsad donation, begränsad cellproliferativ kapacitet, kvalitetsvariationer och biosäkerhetsproblem för eventuell överföring av patogener, om några, från donatorerna11,12.
Humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) härrör från vuxna celler som omprogrammeras med transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc), som har liknande funktioner som embryonala stamceller13,14. De kan förnya sig själva och har potential att differentiera till alla typer av somatiska celler, inklusive MSC. Jämfört med st-MSC har iPSC-MSCs fördelen av obegränsad tillgång, lägre kostnad, högre renhet, bekvämlighet i kvalitetskontroll, lätt för skalproduktion och genmodifiering 15,16,17.
På grund av dessa fördelar med iPSC-MSC har en mängd olika metoder som driver MSC från iPSC rapporterats. Dessa differentieringsmetoder har centrerats kring två odlingsmetoder: (1) bildandet av embryoidkroppar (EB) och (2) användningen av monolagerkulturer 11,18,19,20. Häri karakteriserades ett representativt tillvägagångssätt för var och en av de två metoderna. Dessutom gjordes jämförelser mellan två representativa tillvägagångssätt baserade på tid, kostnad, proliferativ förmåga, uttryck av MSC-biomarkörer och differentieringsförmåga in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll undersöktes två representativa metoder för att differentiera hiPSC till MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Båda metoderna var kapabla att härleda MSC från hiPSCs. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är oerhört tacksamma mot alla medlemmar i Mao och Hu Lab, tidigare och nuvarande, för de intressanta diskussionerna och de stora bidragen till projektet. Vi är tacksamma mot National Clinical Research Center for Child Health för det stora stödet. Denna studie finansierades ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 till Jianhua Mao, 82200784 till Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 till Lidan Hu).
Materials
| Alizarin red staining kit | Beyotime Biotechnology | C0148S | |
| Anti-human-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-human-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-human-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-human-CD73( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-human-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Ascorbic acid | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Carbon dioxide level shaker | Crystal | CO-06UC6 | |
| Compensation Beads | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technology | 07959 | |
| Dexamethasone | Beyotime Biotechnology | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Fetal bovine serum | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| human IgG1 isotype control APC | BioLegend | 403505 | |
| human IgG1 isotype control FITC | BioLegend | 403507 | |
| human IgG1 isotype control PE | BioLegend | 403503 | |
| Human TGF-β1 | Stemcell | 78067 | |
| Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotechnology | ST1398 | |
| Indomethacin | Solarbio | SI9020 | |
| Insulin | Beyotime Biotechnology | P3376 | |
| iPSC maintenance medium | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotechnology | C0341-10mL | |
| Matrigel, growth factor reduced | BD Corning | 354230 | |
| Oli Red O staining kit | Beyotime Biotechnology | C0158S | |
| Proline | Solarbio | P0011 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ3 | Novoprotein | CJ44 | |
| Toluidine blue staining kit | Solarbio | G2543 | |
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| α-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glycerophosphate | Solarbio | G8100 |
Riferimenti
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
- Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
- Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
- Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
- Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
- Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
- Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
- Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
- Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
- Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus – Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
- Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
- Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
- Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
- Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
- Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
- Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
- Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
- Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
- Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
- Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
- Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).
