JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia

Sammenligning av to representative metoder for differensiering av humane induserte pluripotente stamceller til mesenkymale stromale celler

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65729
, , , , ,
1National Clinical Research Center for Child Health,The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology,The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory,Zhejiang University

Summary

Denne protokollen beskriver og sammenligner to representative metoder for å differensiere hiscc til mesenkymale stromale celler (MSC). Monolagsmetoden er preget av lavere kostnad, enklere drift og enklere osteogen differensiering. Embryoidlegememetoden (EB) er preget av lavere tidsforbruk.

Abstract

Mesenkymale stromale celler (MSC) er voksne pluripotente stamceller som har blitt mye brukt i regenerativ medisin. Ettersom somatiske vevsavledede MSC-er er begrenset av begrenset donasjon, kvalitetsvariasjoner og biosikkerhet, har de siste 10 årene sett en stor økning i innsatsen for å generere MSC fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs). Tidligere og nyere innsats i differensiering av hissc i MSC har vært sentrert rundt to kulturmetoder: (1) dannelsen av embryoidlegemer (EB) og (2) bruken av monolagskultur. Denne protokollen beskriver disse to representative metodene for å utlede MSC fra hiPSCer. Hver metode presenterer sine fordeler og ulemper, inkludert tid, kostnad, celleproliferasjonsevne, ekspresjon av MSC-markører og deres evne til differensiering in vitro. Denne protokollen viser at begge metodene kan utlede modne og funksjonelle MSC-er fra hiPSCer. Monolagsmetoden er preget av lavere kostnad, enklere drift og enklere osteogen differensiering, mens EB-metoden er preget av lavere tidsforbruk.

Introduction

Mesenkymale stromale celler (MSC) er mesodermavledede voksne pluripotente stamceller1. MSC finnes i nesten alle bindevev2. Siden MSC først ble oppdaget på 1970-tallet og vellykket isolert fra benmarg i 1987 av Friedenstein et al.3,4,5, har en rekke humane somatiske (inkludert foster og voksen) vev blitt brukt til å isolere MSC som bein, brusk, sener, muskel, fettvev og hematopoietisk støttende stroma 1,2,6,7. MSC demonstrerer høy proliferativ evne og plastisitet for å differensiere i mange somatiske cellelinjer og kan migrere til skadet og betent vev 2,8,9. Disse egenskapene gjør MSC til en potensiell kandidat for regenerativ medisin10. Imidlertid er somatiske vevsavledede MSCer (st-MSC) begrenset av begrenset donasjon, begrenset celleproliferativ kapasitet, kvalitetsvariasjoner og biosikkerhetsbekymring for mulig overføring av patogener, hvis noen, fra giverne11,12.

Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs) er avledet fra voksne celler som omprogrammerer med transkripsjonsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc), som har lignende funksjoner som embryonale stamceller 13,14. De kan selvfornye seg og ha potensialet til å differensiere til alle typer somatiske celler, inkludert MSC. Sammenlignet med st-MSC har iPSC-MSC fordelen av ubegrenset forsyning, lavere kostnad, høyere renhet, bekvemmelighet i kvalitetskontroll, enkel for skalaproduksjon og genmodifisering 15,16,17.

På grunn av disse fordelene med iPSC-MSC, har en rekke metoder som driver MSC fra iPSC blitt rapportert. Disse differensieringsmetodene har vært sentrert rundt to kulturmetoder: (1) dannelsen av embryoidlegemer (EB) og (2) bruken av monolagskulturer 11,18,19,20. Her ble en representativ tilnærming for hver av de to metodene karakterisert. Videre ble sammenligninger mellom to representative tilnærminger basert på tid, kostnad, spredningsevne, uttrykk for MSC-biomarkører og differensieringsevne in vitro også tilgjengelig.

Protocol

1. Vedlikehold av hiPSCs Tining av hiscTa ut cellene fra det flytende nitrogenet og tine cellene raskt i et vannbad på 37 °C. Overfør tinecellene til et 15 ml rør klargjort med 3 ml iPSC vedlikeholdsmedium (materialfortegnelse). Bland mediet forsiktig. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 1 ml iPSC vedlikeholdsmedium med 10 μM Y-27632 (pipett cellene opp og ned 2-3 ganger). Overfør ce…

Representative Results

Etter protokollen (figur 1A) ble hissc differensiert til MSC via EB-formasjons- og monolagskulturmetodene. Under differensiering viste cellene ulike representative morfologier (figur 1B,C). Som vist i figur 1B viser hiPSC-koloniene typisk kompakt morfologi før differensiering med en klar kant sammensatt av tettpakkede celler. Ensartede sfæriske EBer dannet etter hiPSCs dissosiering og d…

Discussion

I denne protokollen ble to representative metoder for å differensiere hiPSCer til MSC undersøkt 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Begge metodene var i stand til å utlede MSC fra hiPSCs. D…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er svært takknemlige for alle medlemmer av Mao og Hu Lab, fortid og nåtid, for interessante diskusjoner og gode bidrag til prosjektet. Vi er takknemlige til National Clinical Research Center for Child Health for den store støtten. Denne studien ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (U20A20351 til Jianhua Mao, 82200784 til Lidan Hu), Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (nr. LQ22C070004 til Lidan Hu).

Materials

Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272 (2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48 (2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus – Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330 (2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068 (2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10 (2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144 (2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsDifferentiationEmbryoid BodiesMonolayer CultureRegenerative MedicineDisease ModelingPatient-derived Cells
check_url/it/65729?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image