Cryoconservation et évaluation bioénergétique des cellules mononucléées du sang périphérique humain
Summary
Les cellules mononucléées isolées du sang périphérique peuvent être utilisées pour l’analyse des fonctions et des troubles immunitaires, des maladies métaboliques ou des fonctions mitochondriales. Dans ce travail, nous décrivons une méthode standardisée pour la préparation de PBMC à partir de sang total et la cryoconservation ultérieure. La cryoconservation rend ce temps et ce lieu indépendants.
Abstract
Les fonctions physiologiques des cellules eucaryotes reposent sur l’énergie principalement fournie par les mitochondries. Le dysfonctionnement mitochondrial est lié aux maladies métaboliques et au vieillissement. La phosphorylation oxydative joue un rôle décisif, car elle est cruciale pour le maintien de l’homéostasie énergétique. Les PBMC ont été identifiés comme un échantillon peu invasif pour mesurer la fonction mitochondriale et il a été démontré qu’ils reflètent les conditions de la maladie. Cependant, la mesure de la fonction bioénergétique mitochondriale peut être limitée par plusieurs facteurs dans des échantillons humains. Les limites sont la quantité d’échantillons prélevés, le temps d’échantillonnage, qui s’étale souvent sur plusieurs jours, et les emplacements. La cryoconservation des échantillons prélevés peut assurer une collecte et une mesure cohérentes des échantillons. Il faut veiller à ce que les paramètres mesurés soient comparables entre les cellules cryoconservées et les cellules fraîchement préparées. Ici, nous décrivons des méthodes d’isolement et de cryoconservation des PBMC à partir d’échantillons de sang humain afin d’analyser la fonction bioénergétique des mitochondries dans ces cellules. Les PBMC cryoconservés selon le protocole décrit ici ne montrent que des différences mineures dans le nombre et la viabilité des cellules, les niveaux d’adénosine triphosphate et l’activité mesurée de la chaîne respiratoire par rapport aux cellules fraîchement récoltées. Seulement 8 à 24 mL de sang humain sont nécessaires pour les préparations décrites, ce qui permet de prélever des échantillons lors d’études cliniques de manière multicentralisée et de déterminer leur bioénergétique sur place.
Introduction
Les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) sont utilisées pour diverses applications dans de nombreux domaines scientifiques, y compris l’étude de questions immunologiques et bioénergétiques, telles que celles liées aux processus de vieillissement ou aux maladies dégénératives 1,2. Les PBMC ont une composition hétérogène et se composent de lymphocytes (lymphocytes B, lymphocytes T et cellules NK), de monocytes et de cellules dendritiques. Les cellules présentent parfois de grandes différences et variations individuelles au sein d’un sujet, de sorte que des procédures standardisées pour la manipulation de ces cellules sont nécessaires. Des paramètres importants tels que la viabilité et la pureté de l’isolant sont les exigences de base pour sa manipulation et sont en outre influencés par des facteurs environnementaux tels que le moment de la collecte, le niveau de mélatonine, si le sujet est à jeun, etc. 3,4.
Sur la base d’études sur la bioénergétique des PBMCs, nous décrivons ici une méthode d’isolement, de cryoconservation et de culture des PBMCs qui convient également à d’autres méthodes. Alors que la biopsie musculaire est considérée comme l’étalon-or pour le métabolisme énergétique mitochondrial5, l’examen des cellules sanguines est une procédure rapide et peu invasive. En plus de cela, de plus en plus d’études suggèrent que les changements dans la fonction mitochondriale dans le vieillissement et la maladie d’Alzheimer (MA) se produisent non seulement dans le cerveau mais aussi dans la périphérie 6,7,8,9,10. La méthode permet également d’étudier d’autres affections et maladies, notamment le diabète sucré et l’obésité 11,12,13. Les modèles d’expression génique chez les patients atteints de sclérose en plaques peuvent être analysés, ou la fonction immunitaire et les influences sur celle-ci en général 14,15,16.
Les PBMC s’appuient généralement sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour générer de l’adénosine triphosphate (ATP)17,18. Par conséquent, les PBMC couvrent un large éventail d’applications en tant que substituts. Dans des rapports précédents, le métabolisme énergétique des PBMC a été utilisé pour traiter des dysfonctionnements d’organes, tels que l’insuffisance cardiaque précoce19, le choc septique20 ou les différences associées au sexe4 dans la fonction mitochondriale. Une méthode généralisée de cryoconservation, d’isolement et de culture des PBMC présenterait des avantages dans la comparabilité des résultats obtenus dans différents instituts. Il y a beaucoup de variations dans les protocoles pour chaque étape21,22, le but de cette méthode est de fournir une ligne directrice pour les mesures bioénergétiques dans les PBMC.
Dans cet article, nous décrivons une méthode de mesure des paramètres bioénergétiques dans les PBMC. Nous expliquons les méthodes d’isolement, de cryoconservation et de mesure de la bioénergétique des PBMC à partir du sang humain. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer les paramètres bioénergétiques chez les patients et les évaluer dans un contexte clinique. Pour appliquer ces mesures, les chercheurs ont besoin d’avoir accès à une population de patients à partir de laquelle des échantillons de sang frais peuvent être obtenus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet d’isoler et de cryoconserver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang humain d’une manière adaptée aux analyses bioénergétiques. La méthode décrite offre la possibilité d’isoler les PBMC en douceur et en grande quantité, avec une viabilité élevée et suffisamment de cellules pour les mesures bioénergétiques. Il présente l’inconvénient que, même avec un minimum d’interruptions, de longs isolements se produisent, mais la cryoconservation ultérieure perm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier l’équipe clinique de l’hôpital universitaire de Giessen-Marburg pour la collecte de sang. Ces travaux ont été financés par l’université Justus Liebig.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
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