क्रायोप्रिजर्वेशन और मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का बायोएनेरजेटिक मूल्यांकन
Summary
पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग प्रतिरक्षा कार्यों और विकारों, चयापचय रोगों या माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इस काम में, हम पूरे रक्त से पीबीएमसी की तैयारी और बाद के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। क्रायोप्रिजर्वेशन इस समय और स्थान को स्वतंत्र बनाता है।
Abstract
यूकेरियोटिक कोशिकाओं के शारीरिक कार्य मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा प्रदान की जाने वाली ऊर्जा पर निर्भर करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन चयापचय रोगों और उम्र बढ़ने से जुड़ा हुआ है। ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण एक निर्णायक भूमिका निभाता है, क्योंकि यह ऊर्जावान होमियोस्टेसिस के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। पीबीएमसी को माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए न्यूनतम इनवेसिव नमूने के रूप में पहचाना गया है और रोग की स्थिति को प्रतिबिंबित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनेरजेटिक फ़ंक्शन का माप मानव नमूनों में कई कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है। सीमाएं लिए गए नमूनों की मात्रा, नमूना समय है, जो अक्सर कई दिनों और स्थानों में फैली हुई है। एकत्र किए गए नमूनों का क्रायोप्रिजर्वेशन नमूनों के लगातार संग्रह और माप को सुनिश्चित कर सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि मापा गया पैरामीटर क्रायोप्रेज़र्व्ड और हौसले से तैयार कोशिकाओं के बीच तुलनीय है। यहां, हम इन कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया के बायोएनेरजेटिक फ़ंक्शन का विश्लेषण करने के लिए मानव रक्त के नमूनों से पीबीएमसी को अलग करने और क्रायोप्रेज़र्विंग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्व सेल नंबर और व्यवहार्यता, एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट के स्तर में केवल मामूली अंतर दिखाते हैं, और ताजा कटाई कोशिकाओं की तुलना में श्वसन श्रृंखला गतिविधि को मापा जाता है। वर्णित तैयारियों के लिए केवल 8-24 एमएल मानव रक्त की आवश्यकता होती है, जिससे नैदानिक अध्ययन के दौरान नमूने बहुकेंद्रीकृत रूप से एकत्र करना और साइट पर उनके बायोएनेरगेटिक्स का निर्धारण करना संभव हो जाता है।
Introduction
मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) प्रतिरक्षाविज्ञानी और bioenergetic मुद्दों, इस तरह के उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं या अपक्षयी रोगों 1,2 से संबंधित उन लोगों के अध्ययन सहित, कई वैज्ञानिक क्षेत्रों में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है. पीबीएमसी संरचना में विषम हैं और इसमें लिम्फोसाइट्स (बी कोशिकाएं, टी कोशिकाएं और एनके कोशिकाएं), मोनोसाइट्स और डेंड्राइटिक कोशिकाएं शामिल हैं। कोशिकाएं कभी-कभी किसी विषय के भीतर महान व्यक्तिगत अंतर और विविधताएं दिखाती हैं, इसलिए इन कोशिकाओं को संभालने के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। व्यवहार्यता और अलगाव की शुद्धता जैसे महत्वपूर्ण पैरामीटर इसके हैंडलिंग के लिए बुनियादी आवश्यकताएं हैं और इसके अतिरिक्त पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित होते हैं जैसे कि संग्रह का समय, मेलाटोनिन स्तर, चाहे विषय उपवास कर रहा हो, और अन्य 3,4।
पीबीएमसी के बायोएनेरगेटिक्स पर अध्ययन के आधार पर, हम यहां पीबीएमसी के अलगाव, क्रायोप्रिजर्वेशन और खेती के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं जो अन्य तरीकों के लिए भी उपयुक्त है। जबकि मांसपेशियों की बायोप्सी को माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय5 के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, रक्त कोशिकाओं की परीक्षा एक तेजी से, न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया है। इसके अलावा, अधिक से अधिक अध्ययनों से पता चलता है कि उम्र बढ़ने और अल्जाइमर रोग (एडी) में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में परिवर्तन न केवल मस्तिष्क में बल्कि परिधि 6,7,8,9,10 में भी होते हैं। विधि भी मधुमेह मेलेटस और मोटापा 11,12,13 सहित अन्य स्थितियों और रोगों की जांच की अनुमति देता है. एकाधिक काठिन्य रोगियों में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण किया जा सकता है, या प्रतिरक्षा समारोह और सामान्य14,15,16 में उस पर प्रभाव.
पीबीएमसी आमतौर पर एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी)17,18उत्पन्न करने के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (ओएक्सएफओएस) पर भरोसा करते हैं। इसलिए, पीबीएमसी सरोगेट्स के रूप में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करते हैं। पिछली रिपोर्टों में, पीबीएमसी के ऊर्जा चयापचय का उपयोग अंग की शिथिलता को संबोधित करने के लिए किया गया है, जैसे कि प्रारंभिक दिल की विफलता19, सेप्टिक शॉक20 या माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में सेक्स से जुड़े अंतर4। क्रायोप्रिजर्वेशन, पृथक्करण और पीबीएमसी की खेती के लिए एक सामान्यीकृत विधि से विभिन्न संस्थानों में प्राप्त परिणामों की तुलनात्मकता में लाभ होगा। प्रत्येक चरण21,22 के लिए प्रोटोकॉल में भिन्नता का एक बड़ा सौदा है, इस पद्धति का लक्ष्य PBMC में bioenergetic माप के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करना है.
इस लेख में हम PBMC में बायोएनेरजेटिक मापदंडों को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम मानव रक्त से पीबीएमसी के बायोएनेरगेटिक्स को अलग करने, क्रायोप्रेज़र्विंग और मापने के तरीकों की व्याख्या करते हैं। इस पद्धति का उपयोग रोगियों में बायोएनेरजेटिक मापदंडों को निर्धारित करने और नैदानिक संदर्भ में उनका मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इन मापों को लागू करने के लिए, शोधकर्ताओं को एक रोगी आबादी तक पहुंच की आवश्यकता होती है जिसमें से ताजा रक्त के नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल बायोएनेरजेटिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त तरीके से मानव रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को अलग करने और क्रायोप्रेज़र्विंग करने का एक साधन प्रदान करता है। वर्णित विध?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रक्त संग्रह के लिए यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गिएसेन-मारबर्ग की नैदानिक टीम को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम जस्टस लिबिग विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologia. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
