Criopreservação e Avaliação Bioenergética de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano
Summary
Células mononucleares isoladas do sangue periférico podem ser usadas para a análise de funções e distúrbios imunológicos, doenças metabólicas ou funções mitocondriais. Neste trabalho, descrevemos um método padronizado para o preparo de CMSP a partir de sangue total e posterior criopreservação. A criopreservação torna esse tempo e lugar independentes.
Abstract
As funções fisiológicas das células eucarióticas dependem da energia fornecida principalmente pelas mitocôndrias. A disfunção mitocondrial está ligada a doenças metabólicas e ao envelhecimento. A fosforilação oxidativa desempenha um papel decisivo, pois é crucial para a manutenção da homeostase energética. PBMCs foram identificados como uma amostra minimamente invasiva para medir a função mitocondrial e demonstraram refletir condições da doença. No entanto, a mensuração da função bioenergética mitocondrial pode ser limitada por vários fatores em amostras humanas. As limitações são a quantidade de amostras coletadas, o tempo de amostragem, que muitas vezes é distribuído por vários dias, e os locais. A criopreservação das amostras coletadas pode garantir a coleta e a medição consistentes das amostras. Deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros medidos sejam comparáveis entre células criopreservadas e recém-preparadas. Aqui, descrevemos métodos de isolamento e criopreservação de CMSP de amostras de sangue humano para analisar a função bioenergética das mitocôndrias nessas células. As CMSP criopreservadas de acordo com o protocolo aqui descrito mostram apenas pequenas diferenças no número e viabilidade celular, nos níveis de trifosfato de adenosina e na atividade da cadeia respiratória medida em comparação com células recém-colhidas. Apenas 8-24 mL de sangue humano são necessários para as preparações descritas, tornando possível coletar amostras durante estudos clínicos multicentralmente e determinar sua bioenergética no local.
Introduction
As células mononucleares do sangue periférico humano (CMSP) são utilizadas para diversas aplicações em diversos campos científicos, incluindo o estudo de questões imunológicas e bioenergéticas, como aquelas relacionadas a processos de envelhecimento ou doenças degenerativas 1,2. As CMSP são heterogêneas em composição e consistem de linfócitos (células B, células T e células NK), monócitos e células dendríticas. As células às vezes mostram grandes diferenças individuais e variações dentro de um sujeito, então procedimentos padronizados para lidar com essas células são necessários. Parâmetros importantes como viabilidade e pureza do isolamento são os requisitos básicos para seu manuseio e são adicionalmente influenciados por fatores ambientais como o tempo de coleta, o nível de melatonina, se o indivíduo está em jejum, entre outros 3,4.
Com base em estudos sobre bioenergética de CMSP, descrevemos aqui um método para o isolamento, criopreserva e cultivo de CMSP que também é adequado para outros métodos. Enquanto a biópsia muscular é considerada o padrão-ouro para o metabolismo energético mitocondrial5, o exame das células sanguíneas é um procedimento rápido e minimamente invasivo. Além disso, cada vez mais estudos sugerem que as alterações da função mitocondrial no envelhecimento e na doença de Alzheimer (DA) ocorrem não só no cérebro, mas também na periferia6,7,8,9,10. O método também permite a investigação de outras condições e doenças, incluindo diabetes mellitus e obesidade11,12,13. Padrões de expressão gênica em pacientes com esclerose múltipla podem ser analisados, assim como a função imune e suas influências em geral 14,15,16.
As CMSP geralmente dependem da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para gerar adenosina trifosfato (ATP)17,18. Portanto, os PBMCs cobrem uma ampla gama de aplicações como substitutos. Em relatos anteriores, o metabolismo energético das CMSP tem sido utilizado para tratar disfunções orgânicas, como na insuficiência cardíaca precoce19, choque séptico20 ou diferenças associadas ao sexo4 na função mitocondrial. Um método generalizado para isolamento criopreservacional e cultivo de CMSP teria vantagens na comparabilidade dos resultados obtidos em diferentes institutos. Há grande variação nos protocolos para cadaetapa21,22, o objetivo desse método é fornecer uma diretriz para medidas bioenergéticas em CMSP.
Neste artigo descrevemos um método para mensuração de parâmetros bioenergéticos em CMSP. Explicamos os métodos para isolar, criopinar e medir a bioenergética de CMSP do sangue humano. Este método pode ser usado para determinar parâmetros bioenergéticos em pacientes e avaliá-los em um contexto clínico. Para aplicar essas medidas, os pesquisadores precisam ter acesso a uma população de pacientes a partir da qual amostras de sangue fresco podem ser obtidas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece um meio de isolar e criopreservar células mononucleares do sangue periférico (CMSP) do sangue humano de forma adequada para análises bioenergéticas. O método descrito oferece a possibilidade de isolar CMSP suavemente e em grandes quantidades, com alta viabilidade e células suficientes para medidas bioenergéticas. Tem a desvantagem de que, mesmo com interrupções mínimas, ocorrem longos isolamentos, mas a criopreservação subsequente permite uma medição independente do tempo da bioenerg?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à equipe clínica do Hospital Universitário Giessen-Marburg pela coleta de sangue. Este trabalho foi financiado pela universidade Justus Liebig.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologia. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
