Криоконсервация и биоэнергетическая оценка мононуклеарных клеток периферической крови человека
Summary
Изолированные мононуклеарные клетки периферической крови могут быть использованы для анализа иммунных функций и нарушений, метаболических заболеваний или митохондриальных функций. В данной работе описан стандартизированный метод получения МПМК из цельной крови и последующей криоконсервации. Криоконсервация делает это время и место независимым.
Abstract
Физиологические функции эукариотических клеток зависят от энергии, в основном обеспечиваемой митохондриями. Митохондриальная дисфункция связана с метаболическими заболеваниями и старением. Окислительное фосфорилирование играет решающую роль, так как оно имеет решающее значение для поддержания энергетического гомеостаза. PBMC были идентифицированы как минимально инвазивный образец для измерения митохондриальной функции и, как было показано, отражают состояние заболевания. Однако измерение биоэнергетической функции митохондрий может быть ограничено несколькими факторами в образцах человека. Ограничениями являются количество взятых проб, время отбора проб, которое часто растягивается на несколько дней, и местоположение. Криоконсервация собранных образцов может обеспечить последовательный сбор и измерение образцов. Следует позаботиться о том, чтобы измеренные параметры были сопоставимы между криоконсервированными и свежеприготовленными клетками. В этой статье мы опишем методы выделения и криоконсервации МПМК из образцов крови человека для анализа биоэнергетической функции митохондрий в этих клетках. Криоконсервированные PBMC в соответствии с протоколом, описанным здесь, показывают лишь незначительные различия в количестве и жизнеспособности клеток, уровнях аденозинтрифосфата и измеренной активности дыхательной цепи по сравнению со свежесобранными клетками. Для описываемых препаратов необходимо всего 8-24 мл человеческой крови, что позволяет проводить многоцентральный отбор образцов в ходе клинических исследований и определять их биоэнергетику на месте.
Introduction
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МПКМ) используются для различных применений во многих научных областях, включая изучение иммунологических и биоэнергетических проблем, таких как те, которые связаны с процессами старения или дегенеративными заболеваниями 1,2. ПБМК неоднородны по составу и состоят из лимфоцитов (В-клеток, Т-клеток и NK-клеток), моноцитов и дендритных клеток. Клетки иногда демонстрируют большие индивидуальные различия и вариации в пределах одного субъекта, поэтому требуются стандартизированные процедуры для работы с этими клетками. Такие важные параметры, как жизнеспособность и чистота изолятора, являются основными требованиями к обращению с ним и дополнительно зависят от факторов окружающей среды, таких как время сбора, уровень мелатонина, голодает ли испытуемый и др. 3,4.
Основываясь на исследованиях биоэнергетики МПМК, мы описываем здесь метод выделения, криоконсервации и культивирования МПМК, который подходит и для других методов. В то время как биопсия мышц считается золотым стандартом митохондриального энергетического метаболизма, исследование клеток крови является быстрой, минимально инвазивной процедурой. В дополнение к этому, все больше и больше исследований показывают, что изменения функции митохондрий при старении и болезни Альцгеймера (БА) происходят не только в головном мозге, но и на периферии 6,7,8,9,10. Метод также позволяет исследовать другие состояния и заболевания, включая сахарный диабет и ожирение 11,12,13. Паттерны экспрессии генов у пациентов с рассеянным склерозом могут быть проанализированы или иммунная функция и влияние на нее в целом 14,15,16.
ПБМК обычно полагаются на окислительное фосфорилирование (OXPHOS) для получения аденозинтрифосфата (АТФ)17,18. Таким образом, PBMC охватывают широкий спектр применений в качестве суррогатов. В предыдущих отчетах энергетический метаболизм PBMC использовался для устранения органных дисфункций, таких как ранняя сердечная недостаточность19, септический шок20 или связанные с полом различия4 в функции митохондрий. Обобщенный метод криоконсервации, выделения и культивирования МПМК будет иметь преимущества в сопоставимости результатов, полученных в разных институтах. Существует большое количество вариаций в протоколах для каждого шага21,22, целью этого метода является предоставление рекомендаций по биоэнергетическим измерениям в PBMC.
В данной статье описан метод измерения биоэнергетических параметров в ПБМК. Описаны методы выделения, криоконсервации и измерения биоэнергетики МПМК из крови человека. Этот метод может быть использован для определения биоэнергетических параметров у пациентов и оценки их в клиническом контексте. Чтобы применить эти измерения, исследователям необходим доступ к популяции пациентов, у которых можно получить свежие образцы крови.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает возможность выделения и криоконсервации мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) из крови человека способом, подходящим для биоэнергетического анализа. Описанный метод позволяет мягко и в больших количествах выделять МПМК с высокой жизнеспособно…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим клиническую команду университетской клиники Гиссен-Марбург за сбор крови. Эта работа финансировалась Университетом Юстуса Либиха.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologia. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
