Criopreservación y Evaluación Bioenergética de Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana
Summary
Las células mononucleares aisladas de sangre periférica se pueden utilizar para el análisis de funciones y trastornos inmunitarios, enfermedades metabólicas o funciones mitocondriales. En este trabajo se describe un método estandarizado para la preparación de PBMCs a partir de sangre total y su posterior criopreservación. La criopreservación hace que este tiempo y lugar sean independientes.
Abstract
Las funciones fisiológicas de las células eucariotas dependen de la energía proporcionada principalmente por las mitocondrias. La disfunción mitocondrial está relacionada con las enfermedades metabólicas y el envejecimiento. La fosforilación oxidativa juega un papel decisivo, ya que es crucial para el mantenimiento de la homeostasis energética. Las PBMC se han identificado como una muestra mínimamente invasiva para medir la función mitocondrial y se ha demostrado que reflejan las condiciones de la enfermedad. Sin embargo, la medición de la función bioenergética mitocondrial puede estar limitada por varios factores en muestras humanas. Las limitaciones son la cantidad de muestras tomadas, el tiempo de muestreo, que a menudo se extiende a lo largo de varios días, y las ubicaciones. La criopreservación de las muestras recogidas puede garantizar la recogida y medición coherentes de las muestras. Se debe tener cuidado de garantizar que los parámetros medidos sean comparables entre las células criopreservadas y las recién preparadas. Aquí, describimos métodos para aislar y criopreservar PBMC de muestras de sangre humana para analizar la función bioenergética de las mitocondrias en estas células. Las PBMC criopreservadas de acuerdo con el protocolo descrito aquí muestran solo diferencias menores en el número y viabilidad de las células, los niveles de trifosfato de adenosina y la actividad de la cadena respiratoria medida en comparación con las células recién recolectadas. Solo se necesitan 8-24 ml de sangre humana para las preparaciones descritas, lo que permite recolectar muestras durante los estudios clínicos de forma multicentralizada y determinar su bioenergética en el sitio.
Introduction
Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se utilizan para diversas aplicaciones en muchos campos científicos, incluido el estudio de cuestiones inmunológicas y bioenergéticas, como las relacionadas con los procesos de envejecimiento o las enfermedades degenerativas 1,2. Las PBMC son de composición heterogénea y están formadas por linfocitos (células B, células T y células NK), monocitos y células dendríticas. Las células a veces muestran grandes diferencias y variaciones individuales dentro de un sujeto, por lo que se requieren procedimientos estandarizados para el manejo de estas células. Parámetros importantes como la viabilidad y la pureza del aislamiento son los requisitos básicos para su manejo y además están influenciados por factores ambientales como el momento de la recolección, el nivel de melatonina, si el sujeto está en ayunas, entre otros 3,4.
Basándonos en estudios sobre la bioenergética de las PBMC, describimos aquí un método para el aislamiento, la criopreservación y el cultivo de PBMC que también es adecuado para otros métodos. Si bien la biopsia muscular se considera el estándar de oro para el metabolismo energético mitocondrial5, el examen de las células sanguíneas es un procedimiento rápido y mínimamente invasivo. Además de esto, cada vez más estudios sugieren que los cambios en la función mitocondrial en el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer (EA) ocurren no solo en el cerebro sino también en la periferia 6,7,8,9,10. El método también permite investigar otras afecciones y enfermedades, como la diabetes mellitus y la obesidad 11,12,13. Se pueden analizar los patrones de expresión génica en pacientes con esclerosis múltiple, o la función inmune y sus influencias en general 14,15,16.
Las PBMC generalmente se basan en la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para generar trifosfato de adenosina (ATP)17,18. Por lo tanto, los PBMC cubren una amplia gama de aplicaciones como sustitutos. En informes anteriores, el metabolismo energético de las PBMC se ha utilizado para abordar las disfunciones orgánicas, como en la insuficiencia cardíaca temprana19, el shock séptico20 o las diferencias asociadas al sexo4 en la función mitocondrial. Un método generalizado para el aislamiento de criopreservación y el cultivo de PBMC tendría ventajas en la comparabilidad de los resultados obtenidos en diferentes institutos. Existe una gran variación en los protocolos para cada paso21,22, el objetivo de este método es proporcionar una guía para las mediciones bioenergéticas en PBMC.
En este artículo describimos un método para medir parámetros bioenergéticos en PBMCs. Explicamos los métodos para aislar, criopreservar y medir la bioenergética de PBMCs de sangre humana. Este método se puede utilizar para determinar parámetros bioenergéticos en pacientes y evaluarlos en un contexto clínico. Para aplicar estas mediciones, los investigadores necesitan acceso a una población de pacientes de la que se puedan obtener muestras de sangre fresca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un medio para aislar y criopreservar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana de una manera adecuada para análisis bioenergéticos. El método descrito ofrece la posibilidad de aislar PBMCs suavemente y en grandes cantidades, con alta viabilidad y suficientes células para mediciones bioenergéticas. Tiene la desventaja de que, incluso con interrupciones mínimas, se producen aislamientos prolongados, pero la criopreservación posterior permite una medición de la b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al equipo clínico del Hospital Universitario de Giessen-Marburg por la extracción de sangre. Este trabajo fue financiado por la universidad Justus Liebig.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
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