Kryokonservering och bioenergetisk utvärdering av humana mononukleära celler i perifert blod
Summary
Isolerade mononukleära celler i perifert blod kan användas för analys av immunfunktioner och störningar, metabola sjukdomar eller mitokondriella funktioner. I detta arbete beskriver vi en standardiserad metod för beredning av PBMC från helblod och efterföljande kryokonservering. Kryokonservering gör denna tid och plats oberoende.
Abstract
De eukaryota cellernas fysiologiska funktioner är beroende av energi som huvudsakligen tillhandahålls av mitokondrier. Mitokondriell dysfunktion är kopplad till metabola sjukdomar och åldrande. Oxidativ fosforylering spelar en avgörande roll, eftersom den är avgörande för upprätthållandet av energisk homeostas. PBMC har identifierats som ett minimalt invasivt prov för att mäta mitokondriell funktion och har visat sig återspegla sjukdomstillstånd. Mätning av mitokondriell bioenergetisk funktion kan dock begränsas av flera faktorer i humana prover. Begränsningar är antalet prover som tas, provtagningstiden, som ofta är utspridd över flera dagar, och platser. Kryokonservering av de insamlade proverna kan säkerställa konsekvent insamling och mätning av prover. Försiktighet bör iakttas för att säkerställa att de uppmätta parametrarna är jämförbara mellan kryokonserverade och nypreparerade celler. Här beskriver vi metoder för att isolera och kryokonservera PBMC från humana blodprover för att analysera mitokondriernas bioenergetiska funktion i dessa celler. PBMC kryokonserverad enligt det protokoll som beskrivs här visar endast mindre skillnader i cellantal och viabilitet, adenosintrifosfatnivåer och uppmätt andningskedjeaktivitet jämfört med nyskördade celler. Endast 8-24 ml humant blod behövs för de beskrivna preparaten, vilket gör det möjligt att samla in prover under kliniska studier multicentralt och bestämma deras bioenergetik på plats.
Introduction
Humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) används för olika tillämpningar inom många vetenskapliga områden, inklusive studier av immunologiska och bioenergetiska frågor, såsom de som är relaterade till åldrandeprocesser eller degenerativa sjukdomar 1,2. PBMC är heterogen i sammansättning och består av lymfocyter (B-celler, T-celler och NK-celler), monocyter och dendritiska celler. Cellerna uppvisar ibland stora individuella skillnader och variationer inom ett ämne, så standardiserade rutiner för att hantera dessa celler krävs. Viktiga parametrar som isoleringens livskraft och renhet är de grundläggande kraven för dess hantering och påverkas dessutom av miljöfaktorer som tidpunkten för insamlingen, melatoninnivån, om försökspersonen fastar och andra 3,4.
Baserat på studier av bioenergetik hos PBMC beskriver vi här en metod för isolering, kryokonservering och odling av PBMC som är lämplig även för andra metoder. Medan muskelbiopsi anses vara guldstandarden för mitokondriell energimetabolism5, är undersökningen av blodkroppar en snabb, minimalt invasiv procedur. Utöver detta tyder fler och fler studier på att förändringarna i mitokondriell funktion vid åldrande och Alzheimers sjukdom (AD) inte bara sker i hjärnan utan även i periferin 6,7,8,9,10. Metoden gör det också möjligt att undersöka andra tillstånd och sjukdomar, bland annat diabetes mellitus och fetma 11,12,13. Genuttrycksmönster hos patienter med multipel skleros kan analyseras, eller immunfunktionen och påverkan på den i allmänhet 14,15,16.
PBMC förlitar sig i allmänhet på oxidativ fosforylering (OXPHOS) för att generera adenosintrifosfat (ATP)17,18. Därför täcker PBMC:er ett brett spektrum av applikationer som surrogatmammor. I tidigare rapporter har energimetabolismen hos PBMC använts för att ta itu med organdysfunktioner, såsom vid tidig hjärtsvikt19, septisk chock20 eller könsrelaterade skillnader4 i mitokondriell funktion. En generaliserad metod för kryokonservering, isolering och odling av PBMC skulle ha fördelar i jämförbarheten av resultat som erhållits vid olika institut. Det finns en stor variation i protokollen för varje steg21,22, målet med denna metod är att ge en riktlinje för bioenergetiska mätningar i PBMC.
I den här artikeln beskriver vi en metod för att mäta bioenergetiska parametrar i PBMC. Vi förklarar metoderna för att isolera, kryokonservera och mäta bioenergetik hos PBMC från humant blod. Denna metod kan användas för att bestämma bioenergetiska parametrar hos patienter och utvärdera dem i ett kliniskt sammanhang. För att kunna tillämpa dessa mätningar behöver forskarna tillgång till en patientpopulation från vilken färska blodprover kan erhållas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt att isolera och kryokonservera mononukleära celler (PBMC) i perifert blod från humant blod på ett sätt som lämpar sig för bioenergetiska analyser. Den beskrivna metoden ger möjlighet att isolera PBMC försiktigt och i stora mängder, med hög viabilitet och tillräckligt med celler för bioenergetiska mätningar. Det har nackdelen att även med minimala avbrott uppstår långa isoleringar, men efterföljande kryokonservering möjliggör en tidsoberoende mätning av bioenergetik. M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka det kliniska teamet på universitetssjukhuset Giessen-Marburg för blodinsamlingen. Detta arbete finansierades av Justus Liebig-universitetet.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
Riferimenti
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologia. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
