Verspreiding van tumorcellen uit longmetastasen volgen met behulp van fotoconversie
Summary
We presenteren een methode voor het bestuderen van de herverspreiding van tumorcellen uit longmetastasen met behulp van een chirurgisch protocol voor de selectieve fotoconversie van longmetastasen, gevolgd door de identificatie van geredissimineerde tumorcellen in tertiaire organen.
Abstract
Metastase – de systemische verspreiding van kanker – is de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen. Hoewel metastase vaak wordt gezien als een unidirectioneel proces waarbij cellen van de primaire tumor zich verspreiden en metastasen zaaien, kunnen tumorcellen in bestaande metastasen zich ook opnieuwverspreiden en aanleiding geven tot nieuwe laesies op tertiaire plaatsen in een proces dat bekend staat als “metastase-van-metastasen” of “metastase-naar-metastase-zaaien”. Het zaaien van metastase naar metastase kan de metastatische belasting verhogen en de kwaliteit van leven en overleving van de patiënt verminderen. Daarom is het begrijpen van de processen achter dit fenomeen cruciaal voor het verfijnen van behandelingsstrategieën voor patiënten met uitgezaaide kanker.
Er is weinig bekend over het zaaien van metastase naar metastase, mede door logistieke en technologische beperkingen. Studies naar het zaaien van metastase naar metastase zijn voornamelijk gebaseerd op sequentiemethoden, wat misschien niet praktisch is voor onderzoekers die de exacte timing van metastase-naar-metastase-zaaigebeurtenissen bestuderen of wat ze bevordert of voorkomt. Dit benadrukt het gebrek aan methodologieën die de studie van metastase-naar-metastase-zaaien vergemakkelijken. Om dit aan te pakken, hebben we een chirurgisch protocol voor muizen ontwikkeld – en beschrijven we hierin – voor de selectieve fotoconversie van longmetastasen, waardoor specifieke markering en lotsbestemming van tumorcellen die zich van de long naar tertiaire plaatsen herverspreiden, mogelijk wordt. Voor zover wij weten, is dit de enige methode voor het bestuderen van de herverspreiding van tumorcellen en het zaaien van metastase naar metastase vanuit de longen waarvoor geen genomische analyse nodig is.
Introduction
Metastase is de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen1. Uitgezaaide kanker ontstaat wanneer cellen van de primaire tumor zich door het lichaam verspreiden en zich vermenigvuldigen tot klinisch detecteerbare tumoren in verre organen 2,3.
Hoewel metastase vaak wordt gezien als een unidirectioneel proces waarbij tumorcellen zich verspreiden vanuit de primaire tumor en verre organen koloniseren4, suggereert toenemend klinisch en experimenteel bewijs dat er een complexer, multidirectioneel proces in het spel is. Het is aangetoond dat circulerende tumorcellen de primaire tumor opnieuw kunnen inzaaien (indien nog steeds op zijn plaats)5,6,7,8,9, en tumorcellen uit bestaande gemetastaseerde foci kunnen naar tertiaire plaatsen reizen en aanleiding geven tot nieuwe laesies 10,11,12,13. Inderdaad, bewijs uit recente genomische analyses suggereert dat sommige metastatische laesies niet voortkomen uit de primaire tumor, maar uit andere metastasen – een fenomeen dat bekend staat als “metastase-van-metastasen” of “metastase-naar-metastase-zaaien”14,15,16. Het zaaien van metastase naar metastase kan het ziekteproces bestendigen, zelfs na verwijdering van de primaire tumor, waardoor de metastatische belasting toeneemt en de kwaliteit van leven en overleving van de patiënt afneemt. Daarom is het begrijpen van de processen achter het zaaien van metastase naar metastase cruciaal voor het verfijnen van behandelingsstrategieën voor patiënten met gemetastaseerde ziekte.
Ondanks de potentieel ernstige klinische implicaties is er weinig bekend over het zaaien van metastase naar metastase, deels als gevolg van logistieke en technologische beperkingen. Studies bij mensen worden beperkt door een gebrek aan klinische monsters. Klinische resectie en biopsie van gemetastaseerde laesies zijn ongebruikelijk, net als de biopsie van ogenschijnlijk gezonde organen, waar enkele gedissemineerde tumorcellen op de loer kunnen liggen. Dit betekent dat studies bij mensen doorgaans alleen mogelijk zijn met behulp van autopsiemonsters van personen van wie de primaire tumoren nog steeds aanwezig zijn of eerder zijn verwijderd, maar nog steeds beschikbaar zijn voor onderzoekers. Wanneer dergelijke monsters beschikbaar zijn, moeten afstammingsanalyses van kankerprogressie worden uitgevoerd met behulp van sequencingmethoden14. Bulksequencing van gematchte primaire tumoren en metastasen heeft echter niet de gevoeligheid die nodig is voor uitgebreide afstammingstracering. Bulksequencing van één laesie kan bijvoorbeeld een subkloon onthullen die niet detecteerbaar is in een van de overeenkomende laesies. In dit geval zou men niet in staat zijn om de oorsprong van deze subkloon te bepalen. Het kan aanwezig zijn geweest in de primaire tumor of een andere metastase met een frequentie onder de detectielimiet, of het kan zijn ontstaan na de eerste kolonisatie van de metastatische laesie waarin het werd gevonden. Single-cell sequencing zorgt voor een verhoogde gevoeligheid, maar de hoge kosten beperken de grootschalige toepassing van deze techniek. Het retrospectieve karakter van deze studies betekent ook dat ze beperkt inzicht geven in voorbijgaande metastatische gebeurtenissen en het ziektelandschap op verschillende tijdstippen.
In diermodellen maken recente technologische ontwikkelingen het nu mogelijk om prospectieve fylogenetische kartering met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie 17,18,19,20 mogelijk te maken. Deze technieken maken gebruik van CRISPR/Cas9-genoombewerking om cellen te ontwerpen met een evoluerende streepjescode – erfelijke mutaties die zich in de loop van de tijd ophopen. Na sequencing kan de afstamming van elke cel worden getraceerd op basis van het mutatieprofiel van de streepjescode 17,18,19,20. Dergelijke technologie wordt inderdaad al gebruikt om het zaaien van metastase naar metastase in kaart te brengen. In een recent artikel toonden Zhang et al. aan dat borst- en prostaatkankercellen in botmetastasen zich herdistribueren van het bot naar zaad secundaire metastasen in meerdere organen21.
Hoewel deze nieuwe methoden een groot potentieel hebben om gedetailleerde, fylogenetische kaarten met hoge resolutie van kankerprogressie te genereren, zijn ze hoogst onpraktisch voor diegenen die de exacte timing van metastase-naar-metastase-zaaigebeurtenissen bestuderen en wat ze bevordert of voorkomt. Het opvullen van deze kennislacunes is cruciaal voor het verfijnen van ons begrip en de behandeling van uitgezaaide kanker, maar er is een merkbaar gebrek aan technologieën om dergelijke studies mogelijk te maken. Om aan deze behoefte tegemoet te komen, hebben we onlangs een nieuwe techniek ontwikkeld – en presenteren we hierin – die ons in staat stelt om tumorcellen specifiek te markeren via fotoconversie op een gemetastaseerde plaats (de long) en ze vervolgens opnieuw te identificeren in tertiaire organen. Met behulp van deze techniek hebben we onlangs aangetoond dat borstkankercellen zich herdistribueren uit longmetastasen en zaad tertiaire organen13. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de timing van herverspreidingsgebeurtenissen binnen een smal venster te bepalen en gerediseerde tumorcellen te kwantificeren, waardoor de studie van organotropisme van gerediseerde cellen wordt vergemakkelijkt en wat herverspreiding bevordert/voorkomt.
Hoewel fotoconversie en lokaal induceerbare cre/lox-systemen die het ene fluorescerende eiwit permanent vervangen door het andere, eerder zijn gebruikt om tumorcellen te markeren en te volgen 11,22,23, is voor zover wij weten geen enkele benadering voor spatiotemporele markering van tumorcellen geoptimaliseerd om zich op de long te richten – een van de meest voorkomende plaatsen van metastase bij mannen en vrouwen bij wie een van de 14 meest voorkomende vormen van kanker is vastgesteld 24. Elk type kankercel en elk protocol voor het genereren van longmetastasen kan worden gebruikt met onze procedure, waardoor het breed bruikbaar is voor metastaseonderzoekers. Alle kankercellen die worden gebruikt om longmetastasen te genereren, moeten een fotoconverteerbaar of fotoschakelbaar eiwit tot expressie brengen, en onderzoekers kunnen kiezen welk eiwit ze willen gebruiken op basis van hun specifieke behoeften en middelen. In deze studie gebruikten we 6DT1-borstkankercellen die stabiel het fotoconverteerbare groen-naar-rood fluorescerende eiwit Dendra2 (6DT1-Dendra2-cellen)25 tot expressie brachten, gelabeld aan het histon H2B. We injecteerden 5,0 × 104 6DT1-Dendra2 cellen in het vierde borstvetkussen van vrouwelijke Rag2-/- muizen. Primaire tumoren waren voelbaar tussen 12 en 16 dagen na injectie en werden niet verwijderd voor de duur van het experiment. Spontane longmetastasen ontwikkelden zich tussen 19 en 26 dagen na de injectie van tumorcellen. Fotoconversieoperaties werden uitgevoerd tussen 26 en 29 dagen na injectie van tumorcellen. Muizen werden 72 uur na de operatie opgeofferd vanwege longmetastaselast.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we een chirurgisch protocol voor de selectieve fotoconversie van tumorcellen in de long. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om selectief tumorcellen in de long te markeren en hun lot te volgen door ze op een later tijdstip door het hele lichaam opnieuw te identificeren, waardoor de studie van metastasen van longmetastasen wordt vergemakkelijkt. Met behulp van dit protocol was het mogelijk om fotoconverteerde cellen in de hersenen, lever en niet-fotoconverteerde rechterlong te visualisere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Wade Koba bedanken voor zijn hulp bij microcomputertomografie (S10RR029545), Vera DesMarais en Hillary Guzik van de Analytical Imaging Facility voor hun training en hulp bij microscopie, het Einstein Montefiore Cancer Center, het National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), het Gruss Lipper Biophotonics Center, het Integrated Imaging Program for Cancer Research, een Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z) en een METAvivor Career Development Award.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
Riferimenti
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Ricerca sul cancro. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Ricerca sul cancro. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
