מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה
Summary
אנו מציגים שיטה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול מגרורות ריאה הכוללת פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, ולאחר מכן זיהוי תאי גידול מחודשים באיברים שלישוניים.
Abstract
גרורות – ההתפשטות המערכתית של סרטן – היא הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן. למרות שנהוג לחשוב על גרורות כתהליך חד-כיווני שבו תאים מהגידול הראשוני מפיצים ושולחים גרורות לזרעים, תאי גידול בגרורות קיימות יכולים גם להפיץ מחדשוליצור נגעים חדשים באתרים שלישוניים בתהליך המכונה “גרורות מגרורות” או “זריעת גרורות לגרורות”. זריעת גרורות לגרורות עלולה להגביר את העומס הגרורתי ולפגוע באיכות חייו ובהישרדותו של החולה. לכן, הבנת התהליכים העומדים מאחורי תופעה זו חיונית לשכלול אסטרטגיות הטיפול בחולים עם סרטן גרורתי.
מעט ידוע על זריעת גרורות לגרורות, בין היתר בשל מגבלות לוגיסטיות וטכנולוגיות. מחקרים על זריעת גרורות לגרורות מסתמכים בעיקר על שיטות ריצוף, שעשויות להיות לא מעשיות עבור חוקרים החוקרים את העיתוי המדויק של אירועי זריעת גרורות לגרורות או מה מקדם או מונע אותם. זה מדגיש את היעדר מתודולוגיות המאפשרים את המחקר של זריעת גרורות לגרורות. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו – ותאר כאן – פרוטוקול כירורגי מוריני להמרה סלקטיבית של גרורות ריאה, המאפשר סימון ספציפי ומעקב אחר גורל של תאי גידול העוברים מהריאה לאתרים שלישוניים. למיטב ידיעתנו, זוהי השיטה היחידה לחקר הפצה מחדש של תאי גידול וזריעת גרורות לגרורות מהריאות שאינה דורשת ניתוח גנומי.
Introduction
גרורות הן הגורם המוביל למוות הקשור לסרטן1. סרטן גרורתי מתעורר כאשר תאים מהגידול הראשוני מתפשטים בכל הגוף ומתרבים לגידולים הניתנים לגילוי קליני באיברים מרוחקים 2,3.
למרות שנהוג לחשוב על גרורות כתהליך חד-כיווני שבו תאי הגידול מתפשטים מהגידול הראשוני ומאכלסים איברים מרוחקים4, עדויות קליניות וניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שקיים תהליך מורכב ורב-כיווני יותר. הוכח כי תאי גידול במחזור הדם יכולים לזרוע מחדש את הגידול הראשוני (אם הוא עדיין במקום)5,6,7,8,9, ותאי גידול ממוקדים גרורתיים קיימים יכולים לנסוע לאתרים שלישוניים וליצור נגעים חדשים 10,11,12,13 . ואכן, עדויות מניתוחים גנומיים שנערכו לאחרונה מצביעות על כך שחלק מהנגעים גרורתיים אינם נובעים מהגידול הראשוני, אלא מגרורות אחרות – תופעה המכונה “גרורות מגרורות” או “זריעת גרורות לגרורות”14,15,16. זריעת גרורות עד גרורות יכולה להנציח את תהליך המחלה גם לאחר הסרת הגידול הראשוני, להגדיל את הנטל הגרורתי ולפגוע באיכות החיים וההישרדות של החולה. לכן, הבנת התהליכים שמאחורי זריעת גרורות לגרורות חיונית לשכלול אסטרטגיות הטיפול בחולים עם מחלה גרורתית.
למרות ההשלכות הקליניות החמורות, מעט ידוע על זריעת גרורות לגרורות, בין היתר בשל מגבלות לוגיסטיות וטכנולוגיות. מחקרים בבני אדם מוגבלים על ידי מיעוט דגימות קליניות. כריתה קלינית וביופסיה של נגעים גרורתיים אינן שכיחות, כמו גם ביופסיה של איברים בריאים לכאורה, שבהם עשויים לארוב תאי גידול בודדים מופצים. משמעות הדבר היא כי מחקרים בבני אדם אפשריים בדרך כלל רק באמצעות דגימות נתיחה מאנשים שהגידולים העיקריים שלהם עדיין במקומם או שנכרתו בעבר אך עדיין זמינים לחוקרים. כאשר דגימות כאלה זמינות, יש לבצע ניתוחי שושלת של התקדמות הסרטן בשיטות ריצוף14. עם זאת, ריצוף בתפזורת של גידולים ראשוניים תואמים וגרורות אינו בעל הרגישות הדרושה למעקב מקיף אחר שושלת. לדוגמה, ריצוף בתפזורת של נגע אחד עשוי לחשוף תת-שיבוט שאינו ניתן לגילוי באף אחד מהנגעים התואמים לו. במקרה זה, לא ניתן יהיה לקבוע את מקורו של תת-שיבוט זה. ייתכן שהוא היה נוכח בגידול הראשוני או גרורות אחרות בתדירות נמוכה מגבול הגילוי, או שהוא נוצר לאחר הקולוניזציה הראשונית של הנגע הגרורתי שבו נמצא. ריצוף תא בודד מספק רגישות מוגברת, אך עלותו הגבוהה מגבילה את היישום בקנה מידה גדול של טכניקה זו. האופי הרטרוספקטיבי של מחקרים אלה פירושו גם שהם מספקים תובנה מוגבלת לגבי אירועים גרורתיים חולפים ונוף המחלה בנקודות זמן שונות.
במודלים של בעלי חיים, ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה מאפשרת כעת מיפוי פילוגנטי פרוספקטיבי ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה 17,18,19,20. טכניקות אלה משתמשות בעריכת גנום CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאים עם ברקוד מתפתח – מוטציות תורשתיות המצטברות עם הזמן. לאחר הריצוף, ניתן לעקוב אחר השושלת של כל תא בהתבסס על הפרופיל המוטציוני של הברקוד 17,18,19,20 שלו. ואכן, טכנולוגיה כזו כבר משמשת למיפוי זריעת גרורות לגרורות. במאמר שפורסם לאחרונה, Zhang et al. הראו כי תאי סרטן השד והערמונית בגרורות עצם מאדים מהעצם לזרע גרורות משניות באיברים מרובים21.
בעוד שלשיטות חדשניות אלה יש פוטנציאל גדול ליצור מפות פילוגנטיות מפורטות ברזולוציה גבוהה של התקדמות הסרטן, הן מאוד לא מעשיות עבור אלה החוקרים את העיתוי המדויק של אירועי זריעת גרורות לגרורות ומה מקדם או מונע אותם. מילוי פערי הידע הללו חיוני לשכלול ההבנה והטיפול שלנו בסרטן גרורתי, אך ניכר מחסור בטכנולוגיות שיאפשרו מחקרים כאלה. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו לאחרונה – ומציגים כאן – טכניקה חדשנית המאפשרת לנו לסמן באופן ספציפי תאים סרטניים באמצעות פוטוהמרה באתר גרורתי (הריאה) ולאחר מכן לזהות אותם מחדש באיברים שלישוניים. באמצעות טכניקה זו, הראינו לאחרונה כי תאי סרטן השד אכן מתאדים מגרורות ריאה ואיברים שלישוניים של זרעים13. טכניקה זו עשויה לשמש גם כדי לקבוע את העיתוי של אירועי הפצה מחדש בתוך חלון צר ולכמת תאים סרטניים redisseminated, להקל על המחקר של organotropism של תאים redisseminated ומה מקדם/מונע הפצה חוזרת.
בעוד שפוטו-המרה ומערכות cre/lox מקומיות המחליפות לצמיתות חלבון פלואורסצנטי אחד בחלבון פלואורסצנטי אחר שימשו בעבר לסימון ומעקב אחר תאי הגידול 11,22,23, למיטב ידיעתנו, שום גישה לסימון מרחבי-זמני של תאי הגידול לא הותאמה למיקוד הריאה – אחד האתרים הנפוצים ביותר של גרורות בקרב גברים ונשים שאובחנו עם כל אחד מ-14 סוגי הסרטן הנפוצים ביותר 24. כל סוג תא סרטני וכל פרוטוקול ליצירת גרורות ריאה ניתן להשתמש עם ההליך שלנו, מה שהופך אותו שימושי באופן נרחב עבור חוקרי גרורות. כל התאים הסרטניים המשמשים ליצירת גרורות ריאה צריכים לבטא חלבון הניתן להמרה או להחלפת אור, וחוקרים יכולים לבחור באיזה חלבון להשתמש בהתבסס על הצרכים והמשאבים הספציפיים שלהם. במחקר זה, השתמשנו ב-6DT1 תאי סרטן שד שביטאו ביציבות את החלבון הפלואורסצנטי Dendra2 (6DT1-Dendra2) הניתן להמרה לאור ירוק-לאדום,25 המתויג להיסטון H2B. הזרקנו 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 תאים לתוך כרית שומן החלב הרביעית של נקבות עכברי Rag2-/- עכברים. גידולים ראשוניים היו מוחשיים בין 12 ל -16 ימים לאחר ההזרקה ולא נכרתו במשך הניסוי. גרורות ריאה ספונטניות התפתחו בין 19 ל -26 ימים לאחר הזרקת תאי הגידול. ניתוחי פוטוקונפורמציה בוצעו בין 26 ל -29 ימים לאחר הזרקת תאי גידול. עכברים הוקרבו עד 72 שעות לאחר הניתוח עקב עומס גרורות ריאתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי להמרה סלקטיבית של תאי גידול בריאה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לסמן באופן סלקטיבי תאים סרטניים בריאה ולעקוב אחר גורלם על ידי זיהויים מחדש בכל הגוף בנקודת זמן מאוחרת יותר, מה שמקל על חקר גרורות מגרורות ריאה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לדמיין תאים פוטו-מו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לווייד קובה על עזרתו בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (S10RR029545), ורה דסמארה והילרי גוזיק ממתקן הדימות האנליטי על הכשרתן ועזרתן במיקרוסקופיה, מרכז הסרטן ע”ש איינשטיין מונטיפיורי, המכון הלאומי לסרטן (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), מרכז גרוס ליפר ביופוטוניקה, תוכנית הדימות המשולבת לחקר הסרטן, מלגת סר הנרי וולקום לפוסט-דוקטורט (221647/Z/20/Z), ופרס METAvivor לפיתוח קריירה.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
Riferimenti
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Ricerca sul cancro. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Ricerca sul cancro. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
