Monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione

Summary

Presentiamo un metodo per lo studio della ridisseminazione delle cellule tumorali da metastasi polmonari che prevede un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, seguito dall'identificazione di cellule tumorali ridisseminate negli organi terziari.

Abstract

Le metastasi - la diffusione sistemica del cancro - sono la principale causa di decessi correlati al cancro. Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule del tumore primario si disseminano e seminano metastasi, le cellule tumorali nelle metastasi esistenti possono anche ridisseminarsi e dare origine a nuove lesioni nei siti terziari in un processo noto come "metastasi da metastasi" o "semina da metastasi a metastasi". La semina da metastasi a metastasi può aumentare il carico metastatico e diminuire la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base di questo fenomeno è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con cancro metastatico.

Poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sulla semina da metastasi a metastasi si basano principalmente su metodi di sequenziamento, che potrebbero non essere pratici per i ricercatori che studiano l'esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi o ciò che li promuove o li previene. Ciò evidenzia la mancanza di metodologie che facilitino lo studio del seeding da metastasi a metastasi. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato - e descriviamo qui - un protocollo chirurgico murino per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, consentendo la marcatura specifica e il monitoraggio del destino delle cellule tumorali che si ridisseminano dal polmone ai siti terziari. Per quanto ne sappiamo, questo è l'unico metodo per studiare la ridisseminazione delle cellule tumorali e la semina da metastasi a metastasi dai polmoni che non richiede l'analisi genomica.

Introduction

Le metastasi sono la principale causa di decessi correlati al cancro¹. Il cancro metastatico insorge quando le cellule del tumore primario si diffondono in tutto il corpo e proliferano in tumori clinicamente rilevabili in organi distanti ^2,3.

Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule tumorali si disseminano dal tumore primario e colonizzano organi^distanti, l'aumento delle evidenze cliniche e sperimentali suggerisce che è in gioco un processo più complesso e multidirezionale. È ....

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, inclusa la previa approvazione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Albert Einstein College of Medicine.

Prima dell'intervento chirurgico, le metastasi polmonari devono essere generate nei topi utilizzando cellule tumorali che esprimono una proteina fotoconvertibile/fotocommutabile; Sono stati pubblicati diversi protocolli per la generazione di metastasi polmonari 26,27,28.

Results

Le fasi dell'intervento chirurgico descritte in questo protocollo sono illustrate nella Figura 1. In breve, il topo viene anestetizzato e i peli vengono rimossi dal torace sinistro. Il topo viene quindi intubato e ventilato, il che consente al topo di ricevere ossigeno mentre la cavità toracica è aperta. I tessuti molli vengono rimossi per esporre la gabbia toracica e viene praticata un'incisione nel 6^° o 7^° muscolo intercostale. Un divaricatore viene inserito nella bre.......

Discussion

In questo articolo, descriviamo un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle cellule tumorali nel polmone. Questa tecnica consente ai ricercatori di contrassegnare selettivamente le cellule tumorali nel polmone e di monitorarne il destino reidentificandole in tutto il corpo in un secondo momento, facilitando lo studio delle metastasi da metastasi polmonari. Utilizzando questo protocollo, è stato possibile visualizzare le cellule fotoconvertite nel cervello, nel fegato e nel polmone destro non fotoconve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alimentazione 0-30 V, 0-3 A	MPJA	9616 PS
12 VDC, 1,2 A Alimentazione a spina non regolata	MPJA	17563 PD
28 G 1 mL BD Siringa per insulina	BD	329410
Lampada array di diodi a emissione luminosa da 400 nm	LedEngin Inc.	897-LZPD0UA00	Lampada di fotoconversione, costruita su misura (singole parti incluse di seguito)
Sutura in seta intrecciata 5-0 con ago da taglio RB-1	Ethicon, Inc.	774B
Cravatta in seta 9 cm 2-0	Ethicon, Inc.	LA55G
Baytril 100 (enrofloxacina)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	Antibiotico utilizzato nell'acqua potabile
Buprenorfina	Hospira	0409-2012-32	analgesici
(assemblaggi di cavi) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD	Mouser	172-0250
Soluzione di clorexidina	Durvet	7-45801-10258-3	Clorexidina Soluzione disinfettante
Contenitore di aria compressa	Falcon	DPSJB-12
Forbici da microdissezione extra fini 4" Dritto Affilato/Affilato 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Micro Forbici da dissezione
Illuminatore a fibre ottiche	O.C. White Company	FL3000	Utilizzato durante l'intubazione del topo
Kit di cauterizzazione Gemini	Harvard Apparatus	726067	Penna cauterica
Germinatore 500	CellPoint Scientific	GER  5287-120V	Sterilizzatore di perline
Pinze Graefe	Roboz	RS-5135
LED ad alta potenza - ultravioletti monocolore 90 watt	Mouser	LZP-D0UA00
Lampada termica a infrarossi	Braintree Scientific	HL-1
Isoflurano SOL 250 mL PVL	Covetrus	29405	anestetico
isoflurano	SurgiVet	VCT302
Portaaghi Jacobson con blocco	Kalson Surgical	T1-140
	Fisher Scientific	S68702
Riflettori per illuminazione a LED CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN	Mouser	928-C11395TM
Applicatori con punta in cotone lungo	Medline Industries	MDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron fino a 3,4 GHz / Cuscinetto a sfere / Nucleo in rame / Ventola di raffreddamento CPU	CompUSA	#S457-1023
Forbici per micro dissezione da 4" Dritte smussate / smussate	Roboz Surgical	RS-5980
ventilatore murino	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Nair Lozione depilatoria	Amazon	B001RVMR7K	Crema depilatoria
Personnet mini divaricatore	Roboz	RS-6504	Divaricatore
Fosfato Soluzione salina tamponata 1x	Fisher Scientific	14190144	PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W	Addgene	51005	Dendra2 lentivirus
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Lubrificante per gli occhi
Supporto per intubazione per roditori	Braintree Scientific	RIS 100
Bulbo di gonfiaggio polmonare per piccoli animali	Apparecchio Harvard	72-9083
Piattaforma chirurgica multifunzionale SurgiSuite per topi, con riscaldamento	Kent Scientific	SURGI-M02	Piattaforma chirurgica riscaldata
Puntali 48" TEST LEAD BANANA - Nero	Mouser	565-1440-48-0
Puntali 48" PUNTALE A BANANA - Rosso	Mouser	565-1440-48-2
Catetere tracheale	Exelint International	26746	Catetere da 22 G
Kit veterinario per sistema di chiusura delle ferite	Clay Adams	IN015	Kit di pinzatura chirurgica veterinaria