Отслеживание диссеминации опухолевых клеток из метастазов в легких с помощью фотоконверсии
Summary
Представлен метод изучения редиссеминации опухолевых клеток из метастазов в легкие, включающий хирургический протокол селективной фотоконверсии метастазов в легких с последующей идентификацией ресеминированных опухолевых клеток в третичных органах.
Abstract
Метастазы – системное распространение рака – являются основной причиной смертей, связанных с раком. Хотя метастазирование обычно рассматривается как однонаправленный процесс, при котором клетки первичной опухоли распространяются и засеивают метастазы, опухолевые клетки в существующих метастазах также могут повторнораспространяться и давать начало новым поражениям в третичных участках в процессе, известном как «метастазирование из метастазов» или «посев метастазов из метастазов». Посев от метастаза к метастазу может увеличить метастатическую нагрузку и снизить качество жизни и выживаемость пациента. Таким образом, понимание процессов, лежащих в основе этого явления, имеет решающее значение для уточнения стратегий лечения пациентов с метастатическим раком.
Мало что известно о посеве от метастаза к метастазу, отчасти из-за логистических и технологических ограничений. Исследования посева от метастазов к метастазам основываются в основном на методах секвенирования, которые могут быть непрактичными для исследователей, изучающих точное время посева от метастазов к метастазам или то, что способствует или предотвращает их. Это подчеркивает отсутствие методологий, облегчающих изучение посева от метастазов к метастазам. Чтобы решить эту проблему, мы разработали и описываем здесь протокол хирургии мышей для селективной фотоконверсии метастазов в легких, позволяющий специфически маркировать и отслеживать судьбу опухолевых клеток, редиссемирующихся из легких в третичные участки. Насколько нам известно, это единственный метод изучения редиссеминации опухолевых клеток и посева метастазов из легких, не требующий геномного анализа.
Introduction
Метастазы являются основной причиной смертности, связанной с раком1. Метастатический рак возникает, когда клетки первичной опухоли распространяются по всему организму и пролиферируют в клинически обнаруживаемые опухоли в отдаленных органах 2,3.
Хотя метастазирование обычно рассматривается как однонаправленныйпроцесс, при котором опухолевые клетки диссемируются из первичной опухоли и колонизируют отдаленные органы, все больше клинических и экспериментальных данных свидетельствуют о том, что имеет место более сложный, разнонаправленный процесс. Было показано, что циркулирующие опухолевые клетки могут повторно засеивать первичную опухоль (если она все еще находится на месте)5,6,7,8,9, а опухолевые клетки из существующих метастатических очагов могут перемещаться в третичные участки и давать начало новым поражениям 10,11,12,13. Действительно, данные недавних геномных анализов свидетельствуют о том, что некоторые метастатические поражения возникают не из первичной опухоли, а из других метастазов – явление, известное как «метастазирование из метастазов» или «посев метастазов в метастазы»14,15,16. Посев от метастаза к метастазу может увековечить патологический процесс даже после удаления первичной опухоли, увеличивая метастатическую нагрузку и снижая качество жизни и выживаемость пациентов. Таким образом, понимание процессов, лежащих в основе посева метастазов, имеет решающее значение для уточнения стратегий лечения пациентов с метастатическим заболеванием.
Несмотря на потенциально тяжелые клинические последствия, мало что известно о посеве от метастаза к метастазу, отчасти из-за логистических и технологических ограничений. Исследования на людях ограничены нехваткой клинических образцов. Клиническая резекция и биопсия метастатических поражений встречаются редко, как и биопсия, казалось бы, здоровых органов, где могут скрываться единичные диссеминированные опухолевые клетки. Это означает, что исследования на людях, как правило, возможны только с использованием образцов аутопсии людей, чьи первичные опухоли либо все еще существуют, либо были ранее удалены, но все еще доступны исследователям. При наличии таких образцов необходимо проводить анализ прогрессирования рака с использованием методов секвенирования14. Однако массовое секвенирование совместимых первичных опухолей и метастазов не обладает чувствительностью, необходимой для комплексного отслеживания родословной. Например, массовое секвенирование одного поражения может выявить субклон, который невозможно обнаружить ни в одном из соответствующих поражений. В этом случае невозможно было бы определить происхождение этого субклона. Он мог присутствовать в первичной опухоли или другом метастазе с частотой ниже предела обнаружения, или он мог возникнуть после первоначальной колонизации метастатического поражения, в котором он был обнаружен. Секвенирование отдельных клеток обеспечивает повышенную чувствительность, но его высокая стоимость ограничивает широкомасштабное применение этой методики. Ретроспективный характер этих исследований также означает, что они дают ограниченное представление о транзиторных метастатических событиях и картине заболевания в разные моменты времени.
В моделях животных последние технологические достижения теперь позволяют проводить перспективное филогенетическое картирование с высоким пространственным и временным разрешением 17,18,19,20. Эти методы используют редактирование генома CRISPR/Cas9 для создания клеток с эволюционирующим штрих-кодом – наследственными мутациями, которые накапливаются с течением времени. При секвенировании можно проследить родословную каждой клетки на основе мутационного профиля ее штрих-кода 17,18,19,20. Действительно, такая технология уже используется для картирования посева метастазов между метастазами. В недавней работе Zhang et al. продемонстрировали, что клетки рака молочной железы и предстательной железы при метастазах в кости редиссеминации из кости в семена вторичных метастазов во многих органах21.
Несмотря на то, что эти новые методы обладают большим потенциалом для создания подробных филогенетических карт прогрессирования рака с высоким разрешением, они крайне непрактичны для тех, кто изучает точное время появления метастазов и то, что способствует или предотвращает их. Восполнение этих пробелов в знаниях имеет решающее значение для уточнения нашего понимания и лечения метастатического рака, но существует заметная нехватка технологий, облегчающих такие исследования. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы недавно разработали и представляем здесь новую методику, которая позволяет нам специфически маркировать опухолевые клетки с помощью фотоконверсии в метастатическом участке (легком) и впоследствии повторно идентифицировать их в третичных органах. Используя этот метод, мы недавно показали, что клетки рака молочной железы действительно размножаются из метастазов в легких и засеивают третичные органы13. Этот метод также может быть использован для определения времени событий редиссеминации в узком окне и количественной оценки редиссеминированных опухолевых клеток, облегчая изучение органотропизма ресеминированных клеток и того, что способствует/предотвращает редиссеминации.
В то время как фотоконверсия и локально-индуцируемые системы cre/lox, которые постоянно заменяют один флуоресцентный белок другим, ранее использовались для маркировки и отслеживания опухолевых клеток 11,22,23, насколько нам известно, ни один подход к пространственно-временной маркировке опухолевых клеток не был оптимизирован для воздействия на легкие – одно из наиболее распространенных мест метастазирования среди мужчин и женщин с диагнозом любой из 14 наиболее распространенных видов рака.. Любой тип раковых клеток и любой протокол образования метастазов в легких могут быть использованы с нашей процедурой, что делает ее широко полезной для исследователей метастазов. Все раковые клетки, используемые для генерации метастазов в легких, должны экспрессировать фотоконвертируемый или фотопереключаемый белок, и исследователи могут выбирать, какой белок использовать, исходя из своих конкретных потребностей и ресурсов. В этом исследовании мы использовали клетки рака молочной железы 6DT1, которые стабильно экспрессировали фотоконвертируемый зелено-красный флуоресцентный белок Dendra2 (клетки 6DT1-Dendra2)25, помеченный гистоном H2B. Мы вводили 5,0 × 104 клеток 6DT1-Dendra2 в четвертую жировую подушку молочной железы самок мышей Rag2-/-. Первичные опухоли пальпировались между 12 и 16 днями после инъекции и не резецировались в течение всего эксперимента. Спонтанные метастазы в легких развивались между 19 и 26 днями после инъекции опухолевых клеток. Операции фотоконверсии проводились между 26 и 29 днями после инъекции опухолевых клеток. Мыши были принесены в жертву через 72 часа после операции из-за метастазирования в легких.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе мы описываем хирургический протокол селективной фотоконверсии опухолевых клеток в легком. Этот метод позволяет исследователям выборочно помечать опухолевые клетки в легких и отслеживать их судьбу, повторно идентифицируя их по всему телу в более поздний момент времен?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Уэйда Коба за помощь в микрокомпьютерной томографии (S10RR029545), Веру ДеМарэ и Хиллари Гузик из Центра аналитической визуализации за их обучение и помощь в микроскопии, Онкологический центр Монтефиоре им. Эйнштейна, Национальный институт рака (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Центр биофотоники им. Грусса Липпера, Программу комплексной визуализации для исследования рака, Стипендия сэра Генри Уэллкома (221647/Z/20/Z) и премия METAvivor за развитие карьеры.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
Riferimenti
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Ricerca sul cancro. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Ricerca sul cancro. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
