Sporing af tumorcelleformidling fra lungemetastaser ved hjælp af fotokonvertering
Summary
Vi præsenterer en metode til at studere tumorcellereformidling fra lungemetastaser, der involverer en kirurgisk protokol til selektiv fotokonvertering af lungemetastaser, efterfulgt af identifikation af redisseminerede tumorceller i tertiære organer.
Abstract
Metastaser – den systemiske spredning af kræft – er den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald. Selvom metastase almindeligvis betragtes som en ensrettet proces, hvor celler fra den primære tumor spredes og frømetastaser, kan tumorceller i eksisterende metastaser også sprede sigigen og give anledning til nye læsioner på tertiære steder i en proces kendt som “metastase-fra-metastaser” eller “metastase-til-metastase-såning.” Metastase-til-metastase såning kan øge den metastatiske byrde og mindske patientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse af processerne bag dette fænomen afgørende for at forfine behandlingsstrategier for patienter med metastatisk kræft.
Lidt er kendt om metastase-til-metastase-såning, delvis på grund af logistiske og teknologiske begrænsninger. Undersøgelser af metastase-til-metastase-såning er primært afhængige af sekventeringsmetoder, hvilket måske ikke er praktisk for forskere, der studerer den nøjagtige timing af metastase-til-metastase-såningsbegivenheder, eller hvad der fremmer eller forhindrer dem. Dette fremhæver manglen på metoder, der letter undersøgelsen af metastase-til-metastase-såning. For at løse dette har vi udviklet – og beskriver heri – en murinkirurgisk protokol til selektiv fotokonvertering af lungemetastaser, der muliggør specifik mærkning og skæbnesporing af tumorceller, der respredes fra lungen til tertiære steder. Så vidt vi ved, er dette den eneste metode til at studere tumorcellereformidling og metastase-til-metastase-såning fra lungerne, der ikke kræver genomisk analyse.
Introduction
Metastaser er den hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald1. Metastatisk kræft opstår, når celler fra den primære tumor spredes i hele kroppen og spredes til klinisk påviselige tumorer i fjerne organer 2,3.
Selvom metastase almindeligvis betragtes som en ensrettet proces, hvor tumorceller spredes fra den primære tumor og koloniserer fjerne organer4, tyder stigende kliniske og eksperimentelle beviser på, at en mere kompleks, multi-directional proces er på spil. Det har vist sig, at cirkulerende tumorceller kan genfrø den primære tumor (hvis den stadig er på plads)5,6,7,8,9, og tumorceller fra eksisterende metastatiske foci kan rejse til tertiære steder og give anledning til nye læsioner 10,11,12,13 . Faktisk tyder beviser fra nyere genomiske analyser på, at nogle metastatiske læsioner ikke stammer fra den primære tumor, men fra andre metastaser – et fænomen kendt som “metastase-fra-metastaser” eller “metastase-til-metastase-såning”14,15,16. Metastase-til-metastase-såning kan fortsætte sygdomsprocessen, selv efter fjernelse af den primære tumor, øge metastatisk byrde og mindske patientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse af processerne bag metastase-til-metastase-såning afgørende for at forfine behandlingsstrategier for patienter med metastatisk sygdom.
På trods af de potentielt alvorlige kliniske implikationer er der lidt kendt om metastase-til-metastase-såning, delvis på grund af logistiske og teknologiske begrænsninger. Humane undersøgelser er begrænset af en mangel på kliniske prøver. Klinisk resektion og biopsi af metastatiske læsioner er ualmindelige, ligesom biopsi af tilsyneladende sunde organer, hvor enkelt disseminerede tumorceller kan lure. Det betyder, at humane undersøgelser typisk kun er mulige ved hjælp af obduktionsprøver fra personer, hvis primære tumorer enten stadig er på plads eller tidligere blev resekteret, men stadig er tilgængelige for forskere. Når sådanne prøver er tilgængelige, skal afstamningsanalyser af kræftprogression udføres ved hjælp af sekventeringsmetoder14. Imidlertid har bulksekventering af matchede primære tumorer og metastaser ikke den følsomhed, der er nødvendig for omfattende afstamningssporing. For eksempel kan bulksekventering af en læsion afsløre en subklon, der ikke kan påvises i nogen af dens matchede læsioner. I dette tilfælde ville man ikke være i stand til at bestemme oprindelsen af denne subklon. Det kan have været til stede i den primære tumor eller en anden metastase med en frekvens under detektionsgrænsen, eller det kan være opstået efter den første kolonisering af den metastatiske læsion, den blev fundet i. Enkeltcellesekventering giver øget følsomhed, men dens høje omkostninger begrænser den store anvendelse af denne teknik. Den retrospektive karakter af disse studier betyder også, at de giver begrænset indsigt i forbigående metastatiske hændelser og sygdomslandskabet på forskellige tidspunkter.
I dyremodeller giver de seneste teknologiske fremskridt nu mulighed for prospektiv fylogenetisk kortlægning med høj rumlig og tidsmæssig opløsning 17,18,19,20. Disse teknikker bruger CRISPR / Cas9 genomredigering til at konstruere celler med en udviklende stregkode – arvelige mutationer, der akkumuleres over tid. Ved sekventering kan hver celles afstamning spores baseret på mutationsprofilen for dens stregkode 17,18,19,20. Faktisk bruges sådan teknologi allerede til at kortlægge metastase-til-metastase-såning. I et nyligt papir viste Zhang et al., at bryst- og prostatacancerceller i knoglemetastaser respredes fra knoglen til frø sekundære metastaser i flere organer21.
Mens disse nye metoder har stort potentiale til at generere detaljerede, højopløselige fylogenetiske kort over kræftprogression, er de meget upraktiske for dem, der studerer den nøjagtige timing af metastase-til-metastase-såningshændelser, og hvad der fremmer eller forhindrer dem. At udfylde disse videnshuller er afgørende for at forfine vores forståelse og behandling af metastatisk kræft, men der er en mærkbar mangel på teknologier til at lette sådanne undersøgelser. For at imødekomme dette behov har vi for nylig udviklet – og præsenterer heri – en ny teknik, der giver os mulighed for specifikt at markere tumorceller via fotokonvertering i et metastatisk sted (lungen) og efterfølgende genidentificere dem i tertiære organer. Ved hjælp af denne teknik viste vi for nylig, at brystkræftceller respredes fra lungemetastaser og frø tertiære organer13. Denne teknik kan også bruges til at bestemme tidspunktet for reformidlingsbegivenheder inden for et snævert vindue og kvantificere redisseminerede tumorceller, hvilket letter undersøgelsen af organotropisme af redisseminerede celler, og hvad der fremmer / forhindrer redisseminering.
Mens fotokonvertering og lokalt inducerbare cre / lox-systemer, der permanent erstatter et fluorescerende protein med et andet, tidligere er blevet brugt til at markere og spore tumorceller 11,22,23, så vidt vi ved, er ingen tilgang til rumlig tidsmæssig mærkning af tumorceller blevet optimeret til at målrette lungen – et af de mest almindelige metastasesteder blandt mænd og kvinder diagnosticeret med nogen af de 14 mest almindelige kræftformer 24. Enhver kræftcelletype og enhver protokol til generering af lungemetastaser kan bruges sammen med vores procedure, hvilket gør den bredt nyttig for metastaseforskere. Alle kræftceller, der bruges til at generere lungemetastaser, skal udtrykke et fotokonvertibelt eller fotoomskifteligt protein, og forskere kan vælge, hvilket protein der skal bruges baseret på deres specifikke behov og ressourcer. I denne undersøgelse brugte vi 6DT1 brystkræftceller, der stabilt udtrykte det fotokonvertible grøn-til-røde fluorescerende protein Dendra2 (6DT1-Dendra2-celler)25 mærket til histon H2B. Vi injicerede 5,0 × 104 6DT1-Dendra2-celler i den fjerde brystfedtpude hos kvindelige Rag2-/- mus. Primære tumorer var håndgribelige mellem 12 og 16 dage efter injektion og blev ikke resekteret i løbet af eksperimentet. Spontane lungemetastaser udviklede sig mellem 19 og 26 dage efter tumorcelleinjektion. Fotokonverteringsoperationer blev udført mellem 26 og 29 dage efter tumorcelleinjektion. Mus blev ofret 72 timer efter operationen på grund af lungemetastasebyrde.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette papir beskriver vi en kirurgisk protokol til selektiv fotokonvertering af tumorceller i lungen. Denne teknik gør det muligt for forskere selektivt at markere tumorceller i lungen og spore deres skæbne ved at genidentificere dem i hele kroppen på et senere tidspunkt, hvilket letter undersøgelsen af metastaser fra lungemetastaser. Ved hjælp af denne protokol var det muligt at visualisere fotokonverterede celler i hjernen, leveren og ikke-fotokonverteret højre lunge hos mus, der havde gennemgået operationen m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Wade Koba for hans hjælp med mikrocomputertomografi (S10RR029545), Vera DesMarais og Hillary Guzik fra Analytical Imaging Facility for deres træning og hjælp med mikroskopi, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, et Sir Henry Wellcome Postdoc-stipendium (221647/Z/20/Z) og en METAvivor Career Development Award.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
Riferimenti
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Ricerca sul cancro. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Ricerca sul cancro. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
