Optogenetisk manipulation af signalveje kan være en stærk strategi til at undersøge, hvordan signalering afkodes i udvikling, regenerering, homeostase og sygdom. Denne protokol giver praktiske retningslinjer for brug af lys-ilt-spændingsdetekterende domænebaserede Nodal og knoglemorfogenprotein (BMP) signalaktivatorer i det tidlige zebrafiskembryo.
Signalveje orkestrerer grundlæggende biologiske processer, herunder udvikling, regenerering, homeostase og sygdom. Metoder til eksperimentelt at manipulere signalering er nødvendige for at forstå, hvordan signalering fortolkes i disse vidtrækkende sammenhænge. Molekylære optogenetiske værktøjer kan tilvejebringe reversible, justerbare manipulationer af signalvejsaktivitet med en høj grad af spatiotemporal kontrol og er blevet anvendt in vitro, ex vivo og in vivo. Disse værktøjer parrer lysresponsive proteindomæner, såsom det blå lys homodimeriserende lys-ilt-spændingssensing (LOV) domæne, med signaleffektorer for at give lysafhængig eksperimentel kontrol over signalering. Denne protokol giver praktiske retningslinjer for anvendelse af det LOV-baserede knoglemorfogenetiske protein (BMP) og Nodal-signalaktivatorerne bOpto-BMP og bOpto-Nodal i det optisk tilgængelige tidlige zebrafiskembryo. Den beskriver to kontroleksperimenter: Et hurtigt fænotypeassay til bestemmelse af passende eksperimentelle betingelser og et immunofluorescensassay til direkte vurdering af signalering. Tilsammen kan disse kontrolforsøg hjælpe med at etablere en pipeline til brug af optogenetiske værktøjer i tidlige zebrafiskembryoner. Disse strategier giver en stærk platform til at undersøge signalernes roller i udvikling, sundhed og fysiologi.
Signalveje gør det muligt for celler at reagere på deres miljø og koordinere aktiviteter på vævs- og organismeskalaer. Signaler, der er afgørende for embryonal udvikling, inkluderer TGF-beta-superfamiliemedlemmerne knoglemorfogenetisk protein (BMP) og Nodal 1,2,3. Under embryogenese mønstrer de veje, der reguleres af disse signaler og andre, kroppens plan ved at kontrollere genekspression og yderligere processer for at sikre, at forskellige væv og organer udvikler sig og interagerer korrekt. Patologier, herunder fosterskader og kræft, kan opstå, når signalering eller reaktioner på signalering forstyrres 4,5,6,7. På trods af grundig undersøgelse af signalering er der stadig meget mere at opdage om, hvordan niveauer og dynamik afkodes i forskellige sammenhænge 8,9,10,11, især under udvikling 12,13,14,15,16,17,18,19.
For at forstå, hvordan signalering afkodes, ville et ideelt eksperiment være at manipulere signalniveauer, timing og / eller dynamik – med en høj grad af rumlig og tidsmæssig kontrol – og vurdere resultater. For eksempel foreslås præcise rumlige signalgradienter til mønsterudvikling af væv20,21. Ændring af rumlige fordelinger af signalgradienter ville hjælpe med at teste denne hypotese22. Derudover bliver vigtigheden af signaldynamik i generering af forskellige cellulære reaktioner tydeligere: Den samme signalvej kan instruere celler til at differentiere eller sprede sig afhængigt af signalfrekvens, for eksempel 9,23. Eksperimentelle paradigmer, hvor signaldynamik let kan manipuleres, vil være værdifulde for at udforske forholdet mellem dynamik og celleskæbnebeslutninger 8,12,13,14,15.
Historisk set er flere metoder blevet brugt til at manipulere signalering i udviklingsmæssige sammenhænge, hvilket fører til grundlæggende opdagelser 1,2,3. Signalering kan blokeres ved hjælp af pathway tab-af-funktion mutanter, ektopisk inhibitor ekspression, eller antagonist narkotika. Metoder til aktivering af signalering omfatter agonistlægemidler, rekombinante ligander, ektopisk ekspression af ligander eller konstitutivt aktive receptorer og pathway-hæmmer tab-af-funktion mutanter. Disse metoder spænder langs et kontinuum af eksperimentel kontrol. For eksempel kan mutanter og ektopisk ekspression falde på forhammersiden af kontinuummet: Med disse tilgange kan dramatiske, systemiske ændringer i vejaktivitet forårsage tidlig død og udelukke undersøgelser på senere stadier eller over tid kan resultere i pleiotropiske virkninger, der er vanskelige at adskille. Derudover er det ofte udfordrende uafhængigt at manipulere en signalfunktion ad gangen, såsom niveau eller varighed. Mod den anden ende af kontinuummet tilbyder nogle metoder mere præcis eksperimentel kontrol, såsom mikrofluidiske enheder, der udsætter prøver for lægemidler eller rekombinante proteiner med tidsmæssig og undertiden rumlig kontrol 18,24,25 eller genetiske metoder, herunder varmechokinducerbare og vævsspecifikke promotorer, der kan tilbyde lignende fordele16,26,27. Disse metoder kan dog være vanskelige at udføre, er muligvis ikke reversible, kan have relativt langsom kinetik eller dårlig opløsning og kan være utilgængelige i nogle modelsystemer.
Molekylære optogenetiske tilgange er en stærk tilføjelse til dette værktøjssæt. Disse tilgange bruger proteiner, der reagerer på forskellige lysbølgelængder til at manipulere biologiske processer, herunder signalering 8,12,13,14,15, og er udviklet over årtier til brug i en række systemer fra cellekultur til hele dyr12,13,28. Sammenlignet med historiske tilgange kan molekylær optogenetik ofte tilbyde en højere grad af rumlig tidsmæssig kontrol over biologiske processer: Regulatoren i optogenetiske systemer er lys, og kontrol af lysbølgelængde, intensitet, varighed og eksponeringsfrekvens er relativt ligetil. Med sofistikerede systemer såsom konfokale og to-fotonmikroskoper er rumlig kontrol i det subcellulære område muligt 29,30,31. Værktøjer til optogenetisk manipulation af signalering er blevet udviklet og anvendt i flere systemer, herunder dem, der er beskrevet i Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 og Huang et al.34. For eksempel blev denne strategi for nylig brugt til at ændre en signalgradient i Drosophila-embryoner, hvilket viser, at flueembryogenese er overraskende robust over for ændringer i denne gradient22. Reversibiliteten og den hurtige tænd/sluk-kinetik af optogenetiske signalaktivatorer har også gjort dem til attraktive værktøjer til at undersøge afkodningen af signaldynamik 8,12,13,14,15,34,35,36.
Det tidlige zebrafiskembryo er et in vivo-system , der er velegnet til optogenetiske undersøgelser, fordi det er eksternt befrugtet, gennemsigtigt, mikroskopivenligt og genetisk medgørligt. Lyseksponering er lettere at levere til embryoner, der udvikler sig uden for moderen, lys kan trænge ind og få adgang til deres ikke-uigennemsigtige væv, levende zebrafiskembryoner tåler billeddannelse godt (ud over at være gennemsigtige), og eksisterende genetiske metoder giver enkle muligheder for knockdown- og overekspressionseksperimenter ud over udviklingen af nyttige transgene stoffer37.
For nylig blev der udviklet optogenetiske værktøjer til at aktivere BMP38 og Nodal39 signalering i zebrafiskembryoner med eksponering for blåt lys (figur 1). Vi henviser til disse værktøjer som bOpto-BMP og bOpto-Nodal (b for blåt lysaktiveret og Opto for optogenetisk). bOpto-BMP/Nodal er baseret på lignende vejaktiveringsmekanismer. Bindingen af BMP eller Nodal ligander til deres respektive receptorserin-threoninkinaser driver receptorkinasedomæneinteraktioner, der fører til phosphorylering af signaleffektorer (Smad1/5/9 for BMP og Smad2/3 for Nodal). Fosforylerede signaleffektorer translokerer derefter til kernen og regulerer målgenekspression3 (figur 1A, D). Disse receptorkinaseinteraktioner kan gøres lysresponsive ved at koble receptorkinaser til lysresponsive dimeriserende proteiner: Ved lyseksponering skal disse kimære proteiner dimerisere, hvilket får receptorkinasedomænerne til at interagere og aktivere signalering (figur 1B, C, E, F). Det er vigtigt, at bOpto-BMP / Nodal i modsætning til endogene receptorer ikke indeholder ekstracellulære ligandbindende domæner, hvilket sikrer liganduafhængig aktivitet (figur 1C, F). Denne optogenetiske aktiveringsstrategi blev først opnået med receptortyrosinkinaser40,41,42 og derefter anvendt på receptorserin-threoninkinaser.
bOpto-BMP/Nodal bruger det blå lysresponsive (~450 nm) homodimeriserende lys-ilt-spændingssensor (LOV) domæne fra algen Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Disse konstruktioner består af et membranmålrettet myristoyleringsmotiv efterfulgt af enten BMP- eller Nodalreceptorkinasedomæner, smeltet sammen med et LOV-domæne (figur 1B, E). Eksponering for blåt lys bør forårsage LOV-homodimerisering, hvilket resulterer i receptorkinasedomæneinteraktioner, der fører til respektive Smad-phosphorylering og vejaktivering (figur 1C, F). For bOpto-BMP viste det sig, at en kombination af konstruktioner med type I-receptorkinasedomænerne fra Acvr1l (også kendt som Alk8) og BMPR1aa (også kendt som Alk3) og type II-receptorkinasedomænet fra BMPR2a optimalt aktiverede signalering38 (Addgene #207614, #207615 og #207616). Til bOpto-Nodal anvendes en kombination af konstruktioner med type I-receptorkinasedomænet fra Acvr1ba og type II-receptorkinasedomænet fra Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal er blevet introduceret i tidlige zebrafiskembryoner ved at injicere mRNA på encellestadiet og brugt til at undersøge signalvarighedens rolle i Nodalfortolkning39, til at bestemme, hvorfor zebrafisk mister evnen til at reagere på Nodal45, og til at undersøge, hvordan BMP-målgener reagerer på forskellige BMP-signalniveauer38. Det er sandsynligt, at disse værktøjer fortsat vil være nyttige i en lang række fremtidige undersøgelser. Imidlertid er styrken af optogenetiske signalaktivatorer også deres svaghed: lysfølsomme prøver skal behandles med omhu for at undgå utilsigtet ektopisk signalaktivitet. Udsættelse for rumlys eller sollys kan aktivere bOpto-BMP/Nodal.
Denne protokol giver praktiske forslag til brug af mRNA-kodede LOV-baserede BMP- og Nodal-aktivatorer i tidlige zebrafiskembryoner. Den begynder med en detaljeret beskrivelse af en strategi til opbygning af en lysboks til styring af ensartet lyseksponering og temperatur (figur 2, supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4, supplerende fil 5, supplerende fil 6, supplerende fil 7, supplerende fil 8). Derefter beskrives to centrale kontroleksperimenter, der bestemmer, om en optogenetisk signalaktivator opfører sig som forventet – dvs. kun aktiverer vejaktivitet, når den udsættes for lys (figur 3). Det første kontrolassay indebærer undersøgelse af fænotyper en dag efter befrugtning i lyseksponerede og ikke-eksponerede embryoner (figur 3A). mRNA-injicerede lyseksponerede embryoner, men ikke ueksponerede embryoner, bør fænokopi BMP eller Nodal overekspression (figur 4A, B; Især BMP-fænotyper er klart forskellige på dette tidspunkt, punkt46). Dette assay giver en hurtig aktivitetsaflæsning. I det andet kontrolassay, for at bestemme, om fænotyper er forårsaget specifikt af overskydende BMP- eller Nodal-signalering og for direkte at observere ændringen i signalniveauer, anvendes immunofluorescensfarvning til at detektere fosforylerede signaleffektorer (henholdsvis pSmad1/5/9 eller pSmad2/3) efter en 20 minutters lyseksponering omkring sen blastula / tidlig gastrulationsfase, når signalaktiviteten er velbeskrevet12, 16,17,47,48,49,50 (figur 3B og figur 4C). (Bemærk, at selvom rumligt lokaliseret aktivering er blevet demonstreret for både bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39, beskriver denne protokol kun ensartet lyseksponering og signalaktiveringsstrategier.) Det tilrådes at udføre disse kontroleksperimenter, inden bOpto-BMP / Nodal anvendes på specifikke forskningsspørgsmål for at bestemme ideelle lokale eksperimentelle forhold.
Injektion af mRNA er den nuværende strategi for at levere bOpto-BMP/Nodal til zebrafiskembryoner. Denne metode har flere ulemper. For det første varierer den passende mængde mRNA mellem laboratorier. Den anvendte mængde skal være tilstrækkelig til at aktivere signalering robust med lyseksponering, men uden utilsigtet mørk aktivering. Det er en god ide at teste flere mængder for at finde optimale mRNA-niveauer, og når de er etableret, skal du oprette alikvoter af en masterblanding for reproducerbart at introducere den samme mængde mRNA. For det andet kan ujævn fordeling af injiceret mRNA føre til ujævn signalaktivering. Injektion i midten af cellen (ikke æggeblommen) menes at fremme selv mRNA-distribution. Endelig, fordi injiceret mRNA nedbrydes over tid, er denne tilgang muligvis ikke egnet til forsøg i ældre embryoner. I fremtiden kan disse problemer løses ved, at transgene zebrafiskelinjer allestedsnærværende udtrykker bOpto-BMP/Nodal med en moderlig eller lægemiddelinducerbar promotor. Selvom arbejdet med potentielt lysfølsomme voksne zebrafisk kan være en udfordring i denne sammenhæng, er zebrafisk 61,62 og Drosophila 22,34,35,63 transgene med optogenetiske værktøjer blevet udviklet med succes.
At undgå utilsigtet fotoaktivering er en generel udfordring med optogenetiske værktøjer. For nemheds skyld skal injicerede embryoner, der er ældre end 1,5 hpf, behandles som lysfølsomme. Utilsigtet lyseksponering kan ofte undgås ved blot at pakke tallerkener eller tallerkener med aluminiumsfolie. For forsøg, der kræver visuel observation af levende embryoner ældre end 1,5 hpf, er det imidlertid muligt at anvende røde lyskilder eller at dække hvide lyskilder med billigt gelfilterpapir, der blokerer LOV-dimeriserende bølgelængder (materialetabel).
Den her beskrevne lysboks er designet til specifikke applikationer, der kræver præcis kontrol over lysindstrålingsniveauer, dynamik og bølgelængder (figur 2). Andre fordele ved denne lysboks inkluderer ensartet lyseksponering, ubetydelig utilsigtet prøveopvarmning, rigelig plads til flere 6-brøndsplader og langlivede, spektralt velkarakteriserede lyskilder. Imidlertid kan forskellige lyseksponeringsstrategier være at foretrække afhængigt af forskningsapplikationen. Mange laboratorier har udviklet enklere og mere omkostningseffektive ensartede lyseksponeringssystemer med mindre fodaftryk, herunder foring af inkubatorer med LED-strimler, ophængning af LED-paneler over prøver eller inkorporering af lysdioder i kulturopvaskelåg 32,38,39,40,64,65,66 . Det er vigtigt, at lysboksen, der anvendes i denne protokol, ikke tillader brugere uafhængigt at regulere individuelle brønde (i modsætning til Bugaj et al.52) eller give rumlig kontrol over lyseksponering. Rumligt lokaliseret optogenetisk aktivering er blevet demonstreret med bOpto-BMP38 og bOpto-Nodal39 ved hjælp af lasere i henholdsvis SPIM eller konfokale systemer og er også blevet realiseret med mange andre optogenetiske strategier i en række modelsystemer (diskuteret i Rogers og Müller12). Nogle tilgange har endda opnået subcellulær rumlig opløsning 29,30,31. Selvom implementeringen af rumligt lokaliserede lyseksponeringssystemer ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, er rumlige aktiveringseksperimenter med bOpto-BMP / Nodal teoretisk mulige med specialudstyr såsom digitale mikrospejlenheder eller maskeringsmetoder. Læsere opfordres til at udforske den omfattende litteratur om DIY-lysbokse til optogenetiske eksperimenter, før de forpligter sig til en lyseksponeringsstrategi (se f.eks. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar og Khammash53 og mere på https://www.optobase.org/materials/).
Molekylære optogenetiske strategier tilbyder ofte en højere grad af rumlig tidsmæssig kontrol over biologiske processer sammenlignet med historiske tilgange som mutanter, ektopisk genekspression, rekombinante proteiner og lægemidler. Læsere, der er interesseret i fordelene ved optogenetiske tilgange, kan udforske andre offentliggjorte værktøjer, der er tilgængelige i zebrafisk og andre organismer. Disse inkluderer værktøjer til at manipulere yderligere signalveje 32,65,67,68, regulere genekspression 61,64,66,69,70,71, ændre proteinlokalisering 31,72 og aktivere apoptose 62. Disse værktøjer og mange andre er bekvemt katalogiseret på OptoBase, en kurateret webressource til molekylær optogenetik tilgange28. For dem, der er inspireret til at skabe nye optogenetiske værktøjer, indeholder ressourcen også nyttige beskrivelser af lysresponsive proteiner, der er blevet anvendt i en lang række strategier, herunder lysresponsive proteiner, der reagerer på grønne, røde og nær-infrarøde bølgelængder. Vi er glade for, at det videnskabelige samfund kan realisere det fulde potentiale af molekylære optogenetiske tilgange.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til denne protokol blev leveret af NICHD Intramural Program til KWR (ZIA HD009002-01). Vi takker Jeff Farrell og hans laboratorium for deres oplysende feedback, Will Anderson for fremragende teknisk support, Leanne Iannucci for at stressteste protokollen og måle bestråling og NIH Shared Zebrafish-anlægget for deres hårde arbejde med at holde zebrafisken sund.
Building a light box & Light exposure protocol | |||
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
Generating mRNA | |||
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
Injecting mRNA | |||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |