सिग्नलिंग मार्गों का ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर यह जांचने के लिए एक शक्तिशाली रणनीति हो सकती है कि विकास, पुनर्जनन, होमियोस्टेसिस और बीमारी में सिग्नलिंग को कैसे डिकोड किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसिंग डोमेन-आधारित नोडल और हड्डी मॉर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग एक्टिवेटर का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करता है।
सिग्नलिंग रास्ते विकास, पुनर्जनन, होमियोस्टैसिस और बीमारी सहित मौलिक जैविक प्रक्रियाओं को ऑर्केस्ट्रेट करते हैं। प्रयोगात्मक रूप से सिग्नलिंग में हेरफेर करने के तरीकों को यह समझने की आवश्यकता है कि इन व्यापक संदर्भों में सिग्नलिंग की व्याख्या कैसे की जाती है। आणविक ऑप्टोजेनेटिक उपकरण उच्च स्तर के स्थानिक नियंत्रण के साथ सिग्नलिंग मार्ग गतिविधि के प्रतिवर्ती, ट्यून करने योग्य जोड़तोड़ प्रदान कर सकते हैं और इन विट्रो, पूर्व विवो और विवो में लागू किए गए हैं। ये उपकरण प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन डोमेन को जोड़ते हैं, जैसे कि ब्लू लाइट होमोडीमेराइजिंग लाइट-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसिंग (एलओवी) डोमेन, सिग्नलिंग प्रभावकों के साथ सिग्नलिंग पर प्रकाश-निर्भर प्रयोगात्मक नियंत्रण प्रदान करने के लिए। यह प्रोटोकॉल LOV-आधारित अस्थि morphogenetic प्रोटीन (BMP) और नोडल सिग्नलिंग एक्टिवेटर bOpto-BMP और bOpto-नोडल ऑप्टिकली सुलभ प्रारंभिक zebrafish भ्रूण में उपयोग करने के लिए व्यावहारिक दिशानिर्देश प्रदान करता है। यह दो नियंत्रण प्रयोगों का वर्णन करता है: उपयुक्त प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए एक त्वरित फेनोटाइप परख, और सीधे सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख। साथ में, ये नियंत्रण प्रयोग प्रारंभिक जेब्राफिश भ्रूण में ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करने के लिए एक पाइपलाइन स्थापित करने में मदद कर सकते हैं। ये रणनीतियाँ विकास, स्वास्थ्य और शरीर विज्ञान में सिग्नलिंग की भूमिकाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करती हैं।
सिग्नलिंग मार्ग कोशिकाओं को अपने पर्यावरण का जवाब देने और ऊतक- और जीव-व्यापी तराजू पर गतिविधियों का समन्वय करने की अनुमति देते हैं। भ्रूण के विकास के लिए महत्वपूर्ण संकेतों में टीजीएफ-बीटा सुपरफैमिली के सदस्य हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) और नोडल 1,2,3 शामिल हैं। भ्रूणजनन के दौरान, इन संकेतों और अन्य द्वारा विनियमित मार्ग जीन अभिव्यक्ति और अतिरिक्त प्रक्रियाओं को नियंत्रित करके शरीर की योजना को पैटर्न करते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विविध ऊतक और अंग विकसित होते हैं और ठीक से इंटरफेस करते हैं। जन्म दोष और कैंसर सहित विकृति, तब हो सकती है जब सिग्नलिंग या सिग्नलिंग के जवाब 4,5,6,7 परेशान होते हैं। सिग्नलिंग में कठोर जांच के बावजूद, विशेष रूप से विकास 12,13,14,15,16,17,18,19 के दौरान विभिन्नसंदर्भों में स्तरों और गतिशीलता को कैसे डिकोड किया जाता है, इसके बारे में बहुत कुछ खोजा जाना बाकी है।
यह समझने के लिए कि सिग्नलिंग को कैसे डिकोड किया जाता है, एक आदर्श प्रयोग सिग्नलिंग स्तर, समय और/या गतिशीलता में हेरफेर करना होगा-उच्च स्तर के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के साथ-और परिणामों का आकलन करना। उदाहरण के लिए, सटीक स्थानिक संकेतन ढाल विकासशील ऊतकों20,21 पैटर्न करने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं. सिग्नलिंग ढाल स्थानिक वितरण को बदलने से इस परिकल्पना22 का परीक्षण करने में मदद मिलेगी। इसके अतिरिक्त, विविध सेलुलर प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने में सिग्नलिंग गतिशीलता का महत्व स्पष्ट होता जा रहा है: एक ही सिग्नलिंग मार्ग कोशिकाओं को सिग्नलिंग आवृत्ति के आधार पर अंतर करने या प्रसार करने का निर्देश दे सकता है, उदाहरण के लिए 9,23। प्रायोगिक प्रतिमान जिसमें सिग्नलिंग गतिशीलता को आसानी से हेरफेर किया जा सकता है, गतिशीलता और सेल भाग्य निर्णयों 8,12,13,14,15के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए मूल्यवान होगा।
ऐतिहासिक रूप से, विकासात्मक संदर्भों में सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, जिससे मौलिक खोजें 1,2,3 हो गई हैं। सिग्नलिंग को पाथवे लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट, एक्टोपिक इनहिबिटर एक्सप्रेशन या विरोधी दवाओं का उपयोग करके अवरुद्ध किया जा सकता है। सिग्नलिंग को सक्रिय करने के तरीकों में एगोनिस्ट ड्रग्स, रिकॉम्बिनेंट लिगैंड्स, लिगेंड की एक्टोपिक अभिव्यक्ति या संवैधानिक रूप से सक्रिय रिसेप्टर्स, और पाथवे इनहिबिटर लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट शामिल हैं। ये विधियां प्रयोगात्मक नियंत्रण की निरंतरता के साथ होती हैं। उदाहरण के लिए, म्यूटेंट और एक्टोपिक अभिव्यक्ति सातत्य के स्लेजहैमर पक्ष पर गिर सकती है: इन दृष्टिकोणों के साथ, मार्ग गतिविधि में नाटकीय, प्रणालीगत परिवर्तन प्रारंभिक मृत्यु का कारण बन सकते हैं और बाद के चरणों में जांच को रोक सकते हैं, या समय के साथ प्लियोट्रोपिक प्रभाव हो सकते हैं जिन्हें अलग करना मुश्किल है। इसके अतिरिक्त, एक समय में एक सिग्नलिंग सुविधा में स्वतंत्र रूप से हेरफेर करना अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है, जैसे स्तर या अवधि। सातत्य के दूसरे छोर की ओर, कुछ विधियां अधिक सटीक प्रयोगात्मक नियंत्रण प्रदान करती हैं, जैसे कि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस जो नमूनों को अस्थायी और कभी-कभी स्थानिक नियंत्रण 18,24,25 के साथ दवाओं या पुनः संयोजक प्रोटीन को उजागर करते हैं, या आनुवंशिक तरीकों से, जिसमें गर्मी के झटके-इंड्यूसिबल और ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर शामिल हैं जो समान लाभ16,26,27 प्रदान कर सकते हैं . हालांकि, इन विधियों को निष्पादित करना मुश्किल हो सकता है, प्रतिवर्ती नहीं हो सकता है, अपेक्षाकृत धीमी गति से कैनेटीक्स या खराब रिज़ॉल्यूशन हो सकता है, और कुछ मॉडल सिस्टम में अनुपलब्ध हो सकता है।
आणविक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण इस टूलकिट के लिए एक शक्तिशाली अतिरिक्त हैं। ये दृष्टिकोण प्रोटीन का उपयोग करते हैं जो जैविक प्रक्रियाओं में हेरफेर करने के लिए विभिन्न प्रकाश तरंग दैर्ध्य का जवाब देते हैं, जिसमें सिग्नलिंग 8,12,13,14,15 शामिल है, और सेल संस्कृति से पूरे जानवरों12,13,28 तक विभिन्न प्रणालियों में उपयोग के लिए दशकों से विकसित किया गया है . ऐतिहासिक दृष्टिकोणों की तुलना में, आणविक ऑप्टोजेनेटिक्स अक्सर जैविक प्रक्रियाओं पर उच्च स्तर के स्थानिक नियंत्रण की पेशकश कर सकते हैं: ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम में नियंत्रक हल्का है, और प्रकाश तरंग दैर्ध्य, तीव्रता, अवधि और जोखिम आवृत्ति का नियंत्रण अपेक्षाकृत सरल है। कॉन्फोकल और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप जैसी परिष्कृत प्रणालियों के साथ, उपकोशिकीय रेंज में स्थानिक नियंत्रण 29,30,31 संभव है। ऑप्टोजेनेटिक रूप से सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए उपकरण कई प्रणालियों में विकसित और लागू किए गए हैं, जिनमें जॉनसन एट अल.22, एपेक एट अल.32, कृष्णमूर्ति एट अल.33, और हुआंग एट अल.34 में वर्णित हैं। उदाहरण के लिए, ऑप्टोजेनेटिक्स द्वारा वहन किए गए स्थानिक नियंत्रण का शोषण, इस रणनीति का उपयोग हाल ही में ड्रोसोफिला भ्रूण में एक सिग्नलिंग ढाल को संशोधित करने के लिए किया गया था, यह दर्शाता है कि मक्खी भ्रूणजनन इस ढाल22 में परिवर्तन के लिए आश्चर्यजनक रूप से मजबूत है। ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग एक्टिवेटर्स की उत्क्रमणीयता और तेजी से ऑन/ऑफ कैनेटीक्स ने उन्हें सिग्नलिंग डायनेमिक्स 8,12,13,14,15,34,35,36 के डिकोडिंग की जांच के लिए आकर्षक उपकरण भी बना दिया है।
प्रारंभिक ज़ेब्राफिश भ्रूण ऑप्टोजेनेटिक अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल विवो प्रणाली में है क्योंकि यह बाहरी रूप से निषेचित, पारदर्शी, माइक्रोस्कोपी-अनुकूल और आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल है। प्रकाश एक्सपोजर भ्रूण है कि मां के बाहर विकसित करने के लिए वितरित करने के लिए आसान है, प्रकाश घुसना और उनके गैर अपारदर्शी ऊतकों का उपयोग कर सकते हैं, जीवित zebrafish भ्रूण इमेजिंग अच्छी तरह से सहन (पारदर्शी होने के अलावा), और मौजूदा आनुवंशिक तरीकों नॉकडाउन और overexpression प्रयोगों के लिए सीधा अवसर प्रदान करते हैं, उपयोगी ट्रांसजेनिक्स37 के विकास के अलावा.
हाल ही में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण नीले प्रकाश जोखिम (चित्रा 1) के साथ जेब्राफिश भ्रूण में बीएमपी38 और नोडल39 सिग्नलिंग को सक्रिय करने के लिए विकसित किए गए थे। हम इन उपकरणों को bOpto-BMP और bOpto-Nodal (ब्लू लाइट-एक्टिवेटेड के लिए b और ऑप्टोजेनेटिक के लिए Opto) के रूप में संदर्भित करते हैं। bOpto-BMP/नोडल समान मार्ग सक्रियण तंत्र पर आधारित हैं। बीएमपी या नोडल लिगैंड को उनके संबंधित रिसेप्टर सेरीन-थ्रेओनीन किनेसेस के लिए बांधना रिसेप्टर किनेज डोमेन इंटरैक्शन को चलाता है जो सिग्नलिंग प्रभावकों के फॉस्फोराइलेशन की ओर ले जाता है (बीएमपी के लिए स्मैड 1/5/9 और नोडल के लिए स्मैड 2/3)। फॉस्फोराइलेटेड सिग्नलिंग प्रभावक तब नाभिक में स्थानांतरित होते हैं और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति3(चित्रा 1ए,डी)को विनियमित करते हैं। इन रिसेप्टर किनेज इंटरैक्शन को रिसेप्टर किनेसेस को प्रकाश-उत्तरदायी डिमराइजिंग प्रोटीन के साथ युग्मन करके प्रकाश-उत्तरदायी बनाया जा सकता है: प्रकाश जोखिम के साथ, इन काइमेरिक प्रोटीनों को मंद होना चाहिए, जिससे रिसेप्टर किनेज डोमेन बातचीत कर सकें और सिग्नलिंग को सक्रिय कर सकें (चित्रा 1 बी, सी, ई, एफ)। महत्वपूर्ण रूप से, अंतर्जात रिसेप्टर्स के विपरीत, बीओपीटीओ-बीएमपी/नोडल में बाह्य लिगैंड-बाइंडिंग डोमेन नहीं होते हैं, जो लिगैंड-स्वतंत्र गतिविधि(चित्रा 1सी, एफ)सुनिश्चित करते हैं। यह ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण रणनीति पहले रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस40,41,42 के साथ हासिल की गई थी और फिर रिसेप्टर सेरीन-थ्रेओनीन किनेसेस पर लागू की गई थी।
bOpto-BMP/नोडल शैवाल Vaucheria fridiga AUREO1 प्रोटीन (VfLOV)43,44से नीले प्रकाश-उत्तरदायी (~ 450 एनएम) homodimerizing प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज संवेदन (LOV) डोमेन का उपयोग करें। इन निर्माणों में एक झिल्ली-लक्ष्यीकरण मायरिस्टोइलेशन आकृति होती है, जिसके बाद बीएमपी या नोडल रिसेप्टर किनेज डोमेन होते हैं, जो एलओवी डोमेन(चित्रा 1बी,ई)से जुड़े होते हैं। ब्लू लाइट एक्सपोजर को एलओवी होमोडीमेराइजेशन का कारण बनना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप रिसेप्टर किनेज डोमेन इंटरैक्शन होता है जो संबंधित स्मैड फॉस्फोराइलेशन और मार्ग सक्रियण(चित्रा 1सी, एफ)का कारण बनता है। bOpto-BMP के लिए, Acvr1l (जिसे Alk8 के रूप में भी जाना जाता है) और BMPR1aa (जिसे Alk3 के रूप में भी जाना जाता है) से टाइप I रिसेप्टर किनेज डोमेन के साथ निर्माणों का संयोजन और BMPR2a से टाइप II रिसेप्टर किनेज डोमेन सिग्नलिंग38 (Addgene #207614, #207615, और #207616) को बेहतर ढंग से सक्रिय करने के लिए पाया गया था। bOpto-नोडल के लिए, Acvr1ba से टाइप I रिसेप्टर किनेज डोमेन और Acvr2ba से टाइप II रिसेप्टर किनेज डोमेन के साथ निर्माणों का एक संयोजन39 का उपयोग किया जाता है।
bOpto-BMP/Nodal को एक-कोशिका चरण में mRNA इंजेक्ट करके प्रारंभिक ज़ेब्राफिश भ्रूण में पेश किया गया है, और नोडल व्याख्या39 में सिग्नलिंग अवधि की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह निर्धारित करने के लिए कि ज़ेब्राफिश नोडल45 का जवाब देने की क्षमता क्यों खो देती है, और यह जांचने के लिए कि बीएमपी लक्ष्य जीन विभिन्न बीएमपी सिग्नलिंग स्तरों38 पर कैसे प्रतिक्रिया देते हैं. यह संभावना है कि ये उपकरण भविष्य की जांच की एक विविध श्रेणी में उपयोगी बने रहेंगे। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग एक्टिवेटर्स की ताकत भी उनकी कमजोरी है: अनजाने में एक्टोपिक सिग्नलिंग गतिविधि से बचने के लिए प्रकाश-संवेदनशील नमूनों को देखभाल के साथ इलाज किया जाना चाहिए। कमरे की रोशनी या सूरज की रोशनी के संपर्क में आने से bOpto-BMP/Nodal सक्रिय हो सकता है।
यह प्रोटोकॉल प्रारंभिक जेब्राफिश भ्रूण में एमआरएनए-एन्कोडेड एलओवी-आधारित बीएमपी और नोडल एक्टिवेटर का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक सुझाव प्रदान करता है। यह वर्दी प्रकाश जोखिम और तापमान (चित्रा 2, पूरक फ़ाइल 1, पूरक फ़ाइल 2, पूरक फ़ाइल 3, पूरक फ़ाइल 4, पूरक फ़ाइल 5, पूरक फ़ाइल 6, पूरक फ़ाइल 7, पूरक फ़ाइल 8) को नियंत्रित करने के लिए एक प्रकाश बॉक्स बनाने के लिए एक रणनीति का विवरण देकर शुरू होता है। यह तब दो प्रमुख नियंत्रण प्रयोगों का वर्णन करता है जो यह निर्धारित करते हैं कि क्या एक ऑप्टोजेनेटिक सिग्नलिंग एक्टिवेटर अपेक्षित व्यवहार कर रहा है-यानी, प्रकाश (चित्रा 3) के संपर्क में आने पर केवल मार्ग गतिविधि को सक्रिय करना। पहले नियंत्रण परख प्रकाश-उजागर और अनपेक्षित भ्रूण(चित्रा 3ए)में एक दिन के बाद निषेचन में फेनोटाइप की जांच करना शामिल है। एमआरएनए-इंजेक्शन प्रकाश-उजागर भ्रूण, लेकिन अनपेक्षित भ्रूण नहीं, बीएमपी या नोडल ओवरएक्सप्रेशन (चित्रा 4ए, बी; विशेष रूप से बीएमपी फेनोटाइप इस समय बिंदु46 पर स्पष्ट रूप से अलग हैं)। यह परख एक तेजी से गतिविधि readout प्रदान करता है. दूसरे नियंत्रण परख में, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या फेनोटाइप विशेष रूप से अतिरिक्त बीएमपी या नोडल सिग्नलिंग के कारण होते हैं और सीधे सिग्नलिंग स्तरों में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला फॉस्फोराइलेटेड सिग्नलिंग प्रभावकों (pSmad1/5/9 या pSmad2/3, क्रमशः) का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है) देर से ब्लास्टुला / प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन चरण के आसपास 20 मिनट के प्रकाश जोखिम के बाद, जब सिग्नलिंग गतिविधि अच्छी तरह से12 वर्णित की गई है, 16,17,47,48,49,50 (चित्र 3B और चित्र 4C)। (ध्यान दें कि, हालांकि स्थानिक रूप से स्थानीयकृत सक्रियण दोनों bOpto-BMP38 और bOpto-Nodal39 के लिए प्रदर्शित किया गया है, यह प्रोटोकॉल केवल समान प्रकाश जोखिम और सिग्नलिंग सक्रियण रणनीतियों का वर्णन करता है। आदर्श स्थानीय प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए विशिष्ट शोध प्रश्नों के लिए bOpto-BMP/Nodal लागू करने से पहले इन नियंत्रण प्रयोगों को निष्पादित करना उचित है।
एमआरएनए का इंजेक्शन जेब्राफिश भ्रूण को bOpto-BMP/Nodal देने की वर्तमान रणनीति है। इस पद्धति में कई कमियां हैं। सबसे पहले, एमआरएनए की उचित मात्रा प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होती है। उपयोग की जाने वाली राशि प्रकाश जोखिम के साथ मजबूती से सिग्नलिंग को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए, लेकिन अनजाने अंधेरे सक्रियण के बिना। इष्टतम एमआरएनए स्तरों को खोजने के लिए कई मात्राओं का परीक्षण करना एक अच्छा विचार है, और एक बार स्थापित होने के बाद, एमआरएनए की समान मात्रा को पुन: प्रस्तुत करने के लिए मास्टर मिक्स के विभाज्य बनाएं। दूसरा, इंजेक्शन mRNA के असमान वितरण से असमान सिग्नलिंग सक्रियण हो सकता है। सेल के केंद्र में इंजेक्शन (जर्दी नहीं) भी mRNA वितरण को बढ़ावा देने के लिए सोचा है. अंत में, क्योंकि इंजेक्शन mRNA समय के साथ नीचा दिखाता है, यह दृष्टिकोण पुराने भ्रूण में प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। भविष्य में, इन समस्याओं को ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों द्वारा सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किया जा सकता है जो मातृ या दवा-इंड्यूसिबल प्रमोटर के साथ बीओपीटी-बीएमपी / यद्यपि संभावित प्रकाश-संवेदनशील वयस्क जेब्राफिश के साथ काम करना इस संदर्भ में एक चुनौती हो सकती है, ज़ेब्राफिश 61,62 और ड्रोसोफिला 22,34,35,63 ट्रांसजेनिक्स को ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को सफलतापूर्वक विकसित किया गया है।
अनजाने फोटोएक्टिवेशन से बचना ऑप्टोजेनेटिक टूल के साथ एक सामान्य चुनौती है। सादगी के लिए, 1.5 एचपीएफ से अधिक पुराने इंजेक्शन भ्रूण को प्रकाश संवेदनशील के रूप में मानें। अनजाने प्रकाश जोखिम को अक्सर केवल प्लेटों या व्यंजनों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटकर बचा जा सकता है। हालांकि, 1.5 एचपीएफ से पुराने जीवित भ्रूण के दृश्य अवलोकन की आवश्यकता वाले प्रयोगों के लिए, लाल प्रकाश स्रोतों का उपयोग करना या सस्ती जेल फिल्टर पेपर के साथ सफेद प्रकाश स्रोतों को कवर करना संभव है जो एलओवी-डिमराइजिंग तरंग दैर्ध्य (सामग्री की तालिका) को अवरुद्ध करता है।
यहां वर्णित प्रकाश बॉक्स विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसमें प्रकाश विकिरण स्तर, गतिशीलता और तरंग दैर्ध्य (चित्रा 2) पर सटीक नियंत्रण की आवश्यकता होती है। इस प्रकाश बॉक्स के अन्य लाभों में वर्दी प्रकाश जोखिम, नगण्य अनजाने नमूना हीटिंग, कई 6-अच्छी प्लेटों के लिए पर्याप्त स्थान, और लंबे समय तक जीवित रहने वाले, वर्णक्रमीय रूप से अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रकाश स्रोत शामिल हैं। हालांकि, अनुसंधान अनुप्रयोग के आधार पर विभिन्न प्रकाश जोखिम रणनीतियों को बेहतर किया जा सकता है। कई प्रयोगशालाओं ने छोटे पैरों के निशान के साथ सरल और अधिक लागत प्रभावी समान प्रकाश एक्सपोजर सिस्टम विकसित किए हैं, जिसमें एलईडी स्ट्रिप्स के साथ इनक्यूबेटरों को अस्तर, नमूनों पर एलईडी पैनलों को निलंबित करना, या संस्कृति डिश ढक्कन 32,38,39,40,64,65,66 में एल ई डी को शामिल करना शामिल है. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्रकाश बॉक्स उपयोगकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से व्यक्तिगत कुओं (बुगाज एट अल.52 के विपरीत) को विनियमित करने या प्रकाश जोखिम पर स्थानिक नियंत्रण प्रदान करने की अनुमति नहीं देता है। स्थानिक स्थानीयकृत optogenetic सक्रियण क्रमशः SPIM या confocal सिस्टम में लेज़रों का उपयोग bOpto-BMP38 और bOpto-नोडल39 के साथ प्रदर्शन किया गया है, और यह भी मॉडल प्रणालियों की एक किस्म में कई अन्य optogenetic रणनीतियों के साथ महसूस किया गया है (रोजर्स और मुलर12 में चर्चा की). कुछ दृष्टिकोणों ने उप-कोशिकीय स्थानिक संकल्प 29,30,31 भी हासिल किया है। यद्यपि स्थानिक रूप से स्थानीयकृत प्रकाश एक्सपोजर सिस्टम का कार्यान्वयन इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है, लेकिन बीओपीटीओ-बीएमपी / नोडल के साथ स्थानिक सक्रियण प्रयोग सैद्धांतिक रूप से डिजिटल माइक्रोमिरर डिवाइस या मास्किंग दृष्टिकोण जैसे विशेष उपकरणों के साथ संभव हैं। पाठकों को प्रकाश जोखिम रणनीति के लिए प्रतिबद्ध होने से पहले ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए DIY प्रकाश बक्से पर व्यापक साहित्य का पता लगाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है (उदाहरण के लिए, गेरहार्ट एट अल.51, बुगाज एट अल.52, कुमार और खम्माश 53 और https://www.optobase.org/materials/ पर अधिक देखें)।
आणविक ऑप्टोजेनेटिक रणनीतियों अक्सर म्यूटेंट, एक्टोपिक जीन अभिव्यक्ति, पुनः संयोजक प्रोटीन और दवाओं जैसे ऐतिहासिक दृष्टिकोणों की तुलना में जैविक प्रक्रियाओं पर उच्च स्तर के स्थानिक नियंत्रण की पेशकश करते हैं। पाठक जो ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण के लाभों में रुचि रखते हैं, वे ज़ेब्राफिश और अन्य जीवों में उपलब्ध अन्य प्रकाशित उपकरणों का पता लगा सकते हैं। इनमें अतिरिक्त सिग्नलिंग रास्ते 32,65,67,68 में हेरफेर करने, जीन अभिव्यक्ति 61,64,66,69,70,71 को विनियमित करने, प्रोटीन स्थानीयकरण31,72 को बदलने और एपोप्टोसिस 62 को सक्रिय करने के लिए उपकरण शामिल हैं . इन उपकरणों और कई अन्य लोगों को आसानी से OptoBase पर सूचीबद्ध कर रहे हैं, आणविक optogenetics दृष्टिकोण28 के लिए एक क्यूरेटेड वेब संसाधन. उपन्यास ऑप्टोजेनेटिक उपकरण बनाने के लिए प्रेरित लोगों के लिए, संसाधन में प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन के उपयोगी विवरण भी शामिल हैं जिन्हें रणनीतियों की एक विस्तृत श्रृंखला में नियोजित किया गया है, जिसमें प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन शामिल हैं जो हरे, लाल और निकट-अवरक्त तरंग दैर्ध्य का जवाब देते हैं। हम वैज्ञानिक समुदाय के लिए आणविक ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण की पूरी क्षमता का एहसास करने के लिए उत्साहित हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रोटोकॉल के लिए फंडिंग NICHD इंट्राम्यूरल प्रोग्राम द्वारा KWR (ZIA HD009002-01) को प्रदान की गई थी। हम जेफ फैरेल और उनकी प्रयोगशाला को उनकी रोशन प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देते हैं, उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए विल एंडरसन, प्रोटोकॉल के तनाव परीक्षण और विकिरण को मापने के लिए लीन इन्नुची, और जेब्राफिश को स्वस्थ रखने के लिए उनकी कड़ी मेहनत के लिए एनआईएच साझा ज़ेब्राफिश सुविधा।
Building a light box & Light exposure protocol | |||
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
Generating mRNA | |||
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
Injecting mRNA | |||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |