तिथि करने के लिए, एक ही माउस से सभी प्रमुख केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी सेल प्रकार के एक साथ अलगाव के लिए प्रोटोकॉल एक unmet मांग कर रहे हैं. प्रोटोकॉल भोले और प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस चूहों में लागू एक प्रक्रिया को दर्शाता है ताकि न्यूरोइन्फ्लेमेशन के दौरान जटिल सेलुलर नेटवर्क की जांच की जा सके और साथ ही आवश्यक चूहों की संख्या को कम किया जा सके।
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के लिए सबसे आम म्यूरिन मॉडल है और अक्सर नई उपचार रणनीतियों को विकसित करने के लिए एमएस के अभी भी अज्ञात एटियलजि को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है। माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) ईएई मॉडल टीकाकरण के बाद 10 दिनों के भीतर आरोही पक्षाघात के साथ एक आत्म-सीमित मोनोफैसिक रोग पाठ्यक्रम को पुन: पेश करता है। नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग करके चूहों की दैनिक जांच की जाती है। एमएस एक विशिष्ट अस्थायी पैटर्न के साथ विभिन्न पैथोमैकेनिज्म द्वारा संचालित होता है, इस प्रकार रोग की प्रगति के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) -निवासी सेल प्रकारों की भूमिका की जांच बहुत रुचि रखती है। इस प्रोटोकॉल की अनूठी विशेषता वयस्क ईएई और स्वस्थ चूहों में लागू सभी प्रमुख सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों (माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स) का एक साथ अलगाव है। वयस्क चूहों से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के पृथक्करण के बाद माइक्रोग्लिया, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग शुद्ध एकल-सेल निलंबन की गुणवत्ता विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो सेल अलगाव के बाद व्यवहार्यता की पुष्टि करता है और लगभग 90% के प्रत्येक सेल प्रकार की शुद्धता का संकेत देता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल स्वस्थ और EAE चूहों में जटिल सेलुलर नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए एक सटीक और व्यापक तरीका प्रदान करता है. इसके अलावा, आवश्यक चूहों की संख्या काफी हद तक कम हो सकती है क्योंकि सभी चार सेल प्रकार एक ही चूहों से अलग होते हैं।
मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की एक पुरानी सूजन ऑटोइम्यून बीमारी है जो डिमाइलिनेशन, एक्सोनल डैमेज, ग्लियोसिस और न्यूरोडीजेनेरेशन की विशेषता है। इस क्षेत्र में कई शोध दृष्टिकोणों के बावजूद, एमएस के पैथोफिज़ियोलॉजी को अभी भीपूरी तरह से 1,2,3,4 समझा नहीं गया है। एमएस की जांच के लिए सबसे आम पशु मॉडल माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन पेप्टाइड 35-55 (एमओजी35-55) -प्रेरित प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) है जो इसकी कई नैदानिक और पैथोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को साझा करता है 5,6,7,8,9. यह सीएनएस-विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया पर आधारित है जो सूजन, विमुद्रीकरण और न्यूरोएक्सोनल अध: पतन के लिए अग्रणी है। प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) एमएस में पाए जाने वाले न्यूरोइन्फ्लेमेटरी रास्ते और सिग्नलिंग कैस्केड की जांच के लिए एक उपयुक्त मॉडल है।
एमएस के लिए वर्तमान चिकित्सा विकल्प केवल आंशिक रूप से प्रभावी हैं और मुख्य रूप से रोग के प्रारंभिक भड़काऊ चरण पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि, एमएस का न्यूरोडीजेनेरेटिव घटक दीर्घकालिक चिकित्सीय दृष्टिकोणों के लिए बड़ी चुनौती प्रतीत होता है। इसलिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और सटीक सेल अलगाव प्रोटोकॉल एक व्यापक तरीके से autoimmune रोगों में आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए आवश्यक हैं. यहां तक कि अगर एक एकल सेल प्रकार के अलगाव के लिए कुछ प्रोटोकॉल 10,11,12,13,14,15 मौजूद हैं, तो एक ही बार में कई सीएनएस-निवासी सेल आबादी के एक साथ अलगाव की आवश्यकता है। सीएनएस-निवासी कोशिकाओं के अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल सेलुलर कार्यक्षमता और शुद्धता के संरक्षण में कमी है, जिसके परिणामस्वरूप पड़ोसी कोशिकाओं 16,17,18 के साथ सह-खेती या इंट्रासेल्युलर नेटवर्क के जटिल विश्लेषण के लिए अनुपयुक्तता पूर्व विवो 19,20,21,22।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य वयस्क स्वस्थ और ईएई चूहों में लागू सभी प्रमुख सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के शुद्ध व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन के एक साथ अलगाव के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और व्यापक विधि स्थापित करना था। विभिन्न सेल प्रकारों को चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस)23का उपयोग करके अलग किया गया था। सेल पृथक्करण या तो सकारात्मक चयन, यानी, सेल-प्रकार-विशिष्ट सतह मार्करों के चुंबकीय लेबलिंग, या बायोटिनाइलेशन और सभी अवांछित कोशिकाओं की कमी के माध्यम से नकारात्मक चयन द्वारा पूरा किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री को 90% से ऊपर की शुद्धता और पृथक एकल-सेल निलंबन के कम से कम 80% की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए लागू किया गया था।
अंत में, मुख्य लक्ष्य स्वस्थ और ईएई चूहों में जटिल सेलुलर नेटवर्क और जैव रासायनिक सिग्नलिंग कैस्केड के व्यापक और सटीक विश्लेषण की पेशकश करने वाले न्यूरोइन्फ्लेमेटरी मार्गों की जांच के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में सभी मुख्य सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना था।
अब तक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आरएनए अनुक्रमण के संयोजन से सीएनएस-निवासी कोशिकाओं पूर्व विवो को मैप करने के तरीके स्वास्थ्य और बीमारी में एक बहुत ही सटीक सेलुलर रूपरेखा प्रदान करते हैं लेकिन इस क्षेत्र में महत्वाकांक्षी तकनीकी ज्ञान और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है50,51. इसके अलावा, वे कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति नहीं देते हैं और बहुत महंगे हैं। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक ब्रेन-ऑन-ए-चिप सिस्टम रोग तंत्र के लिए तेजी से और सस्ती स्क्रीनिंग प्रदान करते हैं और सेल विकास और प्रवासन52,53,54,55 के प्रतिबंध के साथ नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का परीक्षण करते हैं। सीएनएस ऑर्गेनोइड भविष्य में सेलुलर मॉडलिंग, अंतर-सेलुलर कनेक्शन और रोग पाठ्यक्रमों के दौरान बातचीत के लिए एक समकक्ष विकल्प का भी प्रतिनिधित्व कर सकते हैं 56,57,58,59. हालांकि, प्रतिदीप्ति- और चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई वर्तमान में शुद्ध और व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन पूर्व विवो 35,60,61 उत्पन्न करने के लिए सबसे प्रभावी तरीके हैं। यहां तक कि अगर सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के अलगाव के लिए अन्य स्थापित विनिर्माण प्रोटोकॉल चुंबकीय अलगाव और पूर्व सेल पृथक्करण के व्यक्तिगत चरणों के बारे में समान हैं, तो उनका उद्देश्य प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अलग से प्रदर्शन करना है। इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल एक तार्किक संदर्भ में प्रत्येक सीएनएस-निवासी सेल प्रकार के लिए विभिन्न अलगाव विधियों को एकीकृत करता है ताकि उन्हें एक बार में और एक एकल सीएनएस सेल निलंबन(तालिका 1, तालिका 2)से एक साथ प्रदर्शन किया जा सके। इस प्रकार, यह एक एकल सीएनएस सेल निलंबन से बहु-ओमिक्स विश्लेषण और अंततः, जटिल न्यूरोनल नेटवर्क की खोज को सक्षम बनाता है। यहां तक कि अगर यह इस प्रोटोकॉल को करने के लिए कई जानवरों से कई ऊतकों को पूल करने के लिए जरूरी नहीं है, तो यह पूलिंग आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में पृथक कोशिकाओं को सुनिश्चित करता है। एकल कोशिका प्रकारों के अलगाव के लिए विभिन्न चूहों का उपयोग संभावित सेलुलर इंटरैक्शन का विश्लेषण करने की संभावना को बाहर करेगा। इसके अलावा, विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों के लिए अलग-अलग अलगाव विधियों का संयोजन, जो सभी एक पूर्व सीएनएस पृथक्करण का पालन करते हैं, सभी निम्नलिखित चुंबकीय अलगाव चरणों के लिए एक अलग सीएनएस सेल निलंबन का उपयोग करके सामग्री लागत बचाता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न चूहों के उपयोग के कारण होने वाले संभावित तकनीकी पूर्वाग्रह को कम से कम किया जाता है।
प्रोटोकॉल की एक सीमा महिला C57BL/6J चूहों के लगभग अनन्य उपयोग हो सकता है. ईएई टीकाकरण प्रोटोकॉल को महिला चूहों के लिए डिजाइन और स्थापित किया गया है, इसलिए इस सेल अलगाव प्रोटोकॉल को महिला सी 57 बीएल / 6 जे चूहों में भी लागू किया गया था। फिर भी, भोले पुरुष चूहों भी जिसके परिणामस्वरूप सेल संख्या या शुद्धता पर किसी भी प्रभाव को पहचानने के बिना, इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान इस्तेमाल किया गया. एक और प्रतिबंध न्यूरॉन्स के चुंबकीय कोशिका अलगाव को प्रभावित करता है क्योंकि सकारात्मक चयन के संदर्भ में न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए कोई विशिष्ट सूक्ष्म मोती मौजूद नहीं है। यह मान लिया गया था कि एक शुद्ध एकल कोशिका निलंबन बायोटिन लेबलिंग और सभी गैर न्यूरोनल कोशिकाओं(तालिका 2)की कमी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. इस धारणा को न्यूरॉन्स के लिए एक विशिष्ट परमाणु मार्कर के रूप में न्यून के उपयोग द्वारा सत्यापित किया गया था, जो उल्लिखित प्रवाह साइटोमेट्री शुद्धता पैनल में एकीकृत है। एक और सीमा ईएई चूहों में माइक्रोग्लिया के अलगाव की चिंता करती है। यहां, एमएसीएस प्रोटोकॉल के बाद अतिरिक्त छँटाई कदम के कारण अन्य सेल प्रकारों की तुलना में परिणामी सेल पैदावार कम हो जाती है। इसके अलावा, कोई यह तर्क दे सकता है कि छँटाई अन्य सेल आबादी की तुलना में माइक्रोग्लिया के यांत्रिक तनाव को बढ़ाती है। व्यक्तिगत छँटाई रणनीतियों सेल पैदावार की अलग अलग मात्रा के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यदि पृथक सेल नंबर अपेक्षा या वांछित से कम है, तो गेटिंग सेट अप को समायोजित करने और/या जीवित/मृत भेदभाव में सुधार करने की सिफारिश की जाती है।
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम मलबे को हटाने का प्रतिनिधित्व करता है। ढाल बहुत धीरे धीरे और धीरे स्तरित किया जाना चाहिए तीन अलग अलग चरणों (चित्रा 2 ए) बनाने के लिए. केवल अगर दो शीर्ष चरणों में माइलिन और अन्य मलबे के अवशेषों को पूरी तरह से हटा दिया जाता है (चित्र 2E), शुद्ध एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न किया जा सकता है, और आगे संदूषण को कम किया जा सकता है। यदि परिणामी सेल निलंबन शुद्धता की कमी है, तो यह संभवतः प्रोटोकॉल का वह खंड है जिसे पहले सभी माइक्रो-बीड्स के सही उपयोग के आश्वासन के बगल में सुधार किया जाना चाहिए।
शुद्धता और व्यवहार्यता में उच्च स्तर प्राप्त करना इस प्रकार के प्रयोग में चुनौतीपूर्ण हो सकता है। समस्या निवारण के लिए कुछ अनुशंसाएँ हैं:
-बाँझ परिस्थितियों में काम करना विभिन्न सूक्ष्म मोतियों के संदूषण को रोकने और बार-बार उपयोग को सक्षम करने के लिए अनिवार्य है, विशेष रूप से बाद की खेती के लिए।
मिश्रण अप को रोकने के लिए प्रत्येक ट्यूब के लेबलिंग अत्यधिक सिफारिश की है.
-बिना ठंडा अभिकर्मकों/बफ़र्स के उपयोग से बचें। उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए पूरे प्रयोग के दौरान बर्फ पर सभी सेल निलंबन स्टोर करें।
-विभिन्न कार्य चरणों के बीच का समय यथासंभव कम रखें। प्रोटोकॉल में कोई विशिष्ट हिस्सा नहीं है जहां प्रयोग को रोकने की सिफारिश की जाती है।
-निर्दिष्ट इनक्यूबेशन अवधियों का पालन करना अत्यधिक प्रासंगिक है।
अंत में, एक सीएनएस प्रतिकृति से सभी मुख्य सीएनएस-निवासी सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव के लिए यह वर्तमान प्रोटोकॉल एक सीएनएस सेल निलंबन से जटिल न्यूरोनल नेटवर्क और न्यूरोइन्फ्लेमेटरी मार्गों का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है। इस प्रकार, सीएनएस-निवासी कोशिकाओं की जांच रोग पाठ्यक्रमों के विभिन्न चरणों के दौरान की जा सकती है, उदाहरण के लिए, न्यूरोइन्फ्लेमेशन, न्यूरोडीजेनेरेशन और / या ईएई में छूट के दौरान। इसके अलावा, सेल-सेल इंटरैक्शन और जैव रासायनिक मार्गों का अध्ययन व्यक्तिगत स्तर पर किया जा सकता है और प्रयोगात्मक समूहों के भीतर परिवर्तनशीलता को कम किया जा सकता है। आगे कार्यात्मक परख और सत्यापन के लिए मोनोकल्चर में पृथक सीएनएस कोशिकाओं के अंशों की खेती करने का अवसर भी है। सभी एक में, यह प्रोटोकॉल संभावित रूप से प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अनुसंधान दृष्टिकोणों को प्रभावित करने वाली महत्वपूर्ण प्रगति प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
Adobe Illustrator (संस्करण 2023) और Servier Medical Art (https://smart.servier.com) का उपयोग करके आंकड़े बनाए गए थे। एंटोनिया हेन्स को जुरगेन मंचोट स्टिफ्टंग का समर्थन प्राप्त था।
70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |