प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस के एक पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है। यह लेख ईएई में रीढ़ की हड्डी की सूजन, डिमाइलिनेशन और एक्सोनल चोट को स्कोर करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, चूहों के सीरम में घुलनशील न्यूरोफिलामेंट प्रकाश के स्तर को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है, जिससे जीवित चूहों में अक्षीय चोट का आकलन किया जा सकता है।
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) का एक सामान्य प्रतिरक्षा-आधारित मॉडल है। इस बीमारी को माइलिन म्यान और पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) के प्रोटीन घटकों के साथ सक्रिय टीकाकरण द्वारा कृन्तकों में प्रेरित किया जा सकता है या माइलिन प्रोटीन / सीएफए के साथ प्राइमेड कृन्तकों से माइलिन-विशिष्ट टी प्रभावक कोशिकाओं के हस्तांतरण से भोले कृन्तकों में प्रेरित किया जा सकता है। ईएई की गंभीरता आमतौर पर 5-बिंदु नैदानिक पैमाने पर बनाई जाती है जो आरोही पक्षाघात की डिग्री को मापती है, लेकिन यह पैमाना ईएई से वसूली की सीमा का आकलन करने के लिए इष्टतम नहीं है। उदाहरण के लिए, सूजन के संकल्प के बावजूद कुछ ईएई मॉडल (जैसे, माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन [एमओजी] ईएई के पेप्टाइड-प्रेरित मॉडल) में नैदानिक स्कोर उच्च रहते हैं। इस प्रकार, ईएई के हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग के साथ नैदानिक स्कोरिंग को पूरक करना महत्वपूर्ण है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सेलुलर चोट के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने का एक साधन भी प्रदान करता है।
यहाँ, एक सरल प्रोटोकॉल तैयार करने और चूहों से रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क वर्गों दाग और सूजन स्कोर करने के लिए प्रस्तुत किया है, demyelination, और रीढ़ की हड्डी में axonal चोट. रीढ़ की हड्डी में ल्यूकोसाइट घुसपैठ को स्कोर करने की विधि भी ईएई में मस्तिष्क की सूजन को स्कोर करने के लिए लागू की जा सकती है। एक छोटे अणु परख (SIMOA) परख का उपयोग कर चूहों के सीरम में घुलनशील neurofilament प्रकाश (sNF-L) को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल भी जीवित चूहों में समग्र सीएनएस चोट की सीमा पर प्रतिक्रिया प्रदान करता है जो वर्णित.
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मानव डिमाइलेटिंग बीमारी, मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)1के लिए सबसे आम म्यूरिन मॉडल है। क्लासिक एमएस भड़काऊ विकृति, IFN-γ (गामा) और IL-17-उत्पादक टी हेल्पर कोशिकाओं2 की घुसपैठ सहित, भड़काऊ मोनोसाइट्स3 की घुसपैठ, पेरिवास्कुलर और उप-मेनिंगियल भड़काऊ demyelinating घावोंका गठन 4, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) में अक्षतंतु चोट4 की घटना, EAE 5,6,7,8,9 में भी देखी जाती है. ईएई और एमएस के बीच प्रतिरक्षा तंत्र में समानता ने ईएई को एमएस के लिए कई अनुमोदित प्रतिरक्षा-आधारित उपचारों की प्रभावकारिता और तंत्र के परीक्षण के लिए एक उपयुक्त पूर्व-नैदानिक मॉडल बना दिया है, जिसमें नतालिज़ुमाब, फिंगोलिमॉड, डाइमिथाइल फ्यूमरेट और ग्लैटीरामेर एसीटेट (1,5 में समीक्षा की गई) शामिल हैं। कुछ ईएई रेजिमेंस एक्सोनल चोट से परे प्रगतिशील एमएस पैथोलॉजी के अन्य पहलुओं को मॉडल करते हैं, जिसमें मस्तिष्क में उप-मेनिंगियल सूजन, क्रोनिक डिमाइलिनेशन, रीढ़ की हड्डी शोष, सिनैप्स और न्यूरॉन हानि 6,10,11,12 का विकास शामिल है। इस प्रकार, ईएई में एमएस के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव थेरेपी की प्रभावकारिता की जांच के लिए उपयोगिता है।
ईएई कृन्तकों में कई तरीकों से प्रेरित होता है। सक्रिय टीकाकरण सबसे आम प्रेरण विधि है और इसमें माइलिन एंटीजन (या तो पूरे प्रोटीन या पेप्टाइड्स) के साथ कृन्तकों का टीकाकरण शामिल है, जो सीएफए में गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस13 के साथ पूरक है। माउस के तनाव के आधार पर, पर्टुसिस विष (पीटीएक्स) भी रोग13 की पैठ बढ़ाने के लिए टीकाकरण के दिन 0 और दिन 2 पर प्रशासित किया जाता है। ईएई को स्वस्थ चूहों14 में माइलिन / सीएफए-प्राइमेड चूहों से प्राप्त माइलिन-विशिष्ट टी कोशिकाओं को गोद लेने से भी प्रेरित किया जा सकता है या चूहों में अनायास विकसित हो सकता है जो प्रमुख माइलिन एंटीजन5 के लिए विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर्स को ओवरएक्सप्रेस करते हैं।
ईएई रोग की गंभीरता और प्रगति आमतौर पर एक असतत 5-बिंदु नैदानिक पैमाने का उपयोग करके स्कोर की जाती है: 1 – पूंछ लंगड़ापन, 2 – हिंडलिंब या पैर की कमजोरी, 3 – एक या दोनों हिंदलिंब में पूर्ण पक्षाघात, 4 – फोरलिंब कमजोरी, 5 – मरणासन्न या मृत13। यह नैदानिक स्कोरिंग प्रणाली आरोही पक्षाघात की प्रगति का दस्तावेजीकरण करने में ध्वनि है जो रोग की शुरुआत में होती है लेकिन सीएनएस भड़काऊ हमलों से वसूली की सीमा को पकड़ने में कम संवेदनशील है। उदाहरण के लिए, दोनों चूहे जो कठिनाई से चलते हैं और चूहे जो आसानी से एम्बुलेट करते हैं लेकिन पैर-लोभी कमजोरी का प्रदर्शन करते हैं, उन्हें ईएई पैमाने पर 2 का स्कोर सौंपा जाता है। स्थायी अक्षतंतु चोट या हानि की उपस्थिति के कारण ईएई के बाद के तीव्र चरण में स्कोर उच्च रह सकते हैं, यहां तक कि भड़काऊ प्रतिक्रिया9 के संकल्प के बावजूद। ईएई 9,16,17,18 में नैदानिक घाटे में अंतर को बेहतर ढंग से पकड़ने के लिए अधिक परिष्कृत स्कोरिंग सिस्टम, व्यवहार परीक्षण, हिंदलिंब और पकड़ शक्ति के उपाय, और अवरक्त निगरानी प्रणाली विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं; हालांकि, ये अधिक जटिल स्कोरिंग उपाय अंतर्निहित न्यूरोलॉजिकल घाटे में सूजन बनाम ऊतक की चोट के योगदान को अलग नहीं करते हैं। इस प्रकार, ईएई की गंभीरता को स्कोर करने के लिए स्वर्ण मानक दृष्टिकोण नैदानिक और हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग दोनों का संचालन करना है।
यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है कि कैसे पैराफिन में माउस रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के नमूनों को विच्छेदन और एम्बेड किया जाए, जो ईएई में होने वाले घाव के गठन की स्टोकेस्टिक प्रक्रिया को पकड़ता है। एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया जाता है कि लक्सोल फास्ट ब्लू (एलएफबी) के साथ वर्गों को कैसे दाग दिया जाए, मूल रूप से क्लूवर और बैरेरा19 द्वारा बनाया गया है, जो सीएनएस में माइलिन का पता लगाता है। अनुभाग या तो अकेले एलएफबी (डिमाइलिनेशन विश्लेषण के लिए) के साथ दाग दिए जाते हैं या भड़काऊ घावों को देखने और स्कोर करने में मदद करने के लिए हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) के साथ प्रति-दाग होते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) तकनीकों और सार्वजनिक रूप से सुलभ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी में कुल ल्यूकोसाइट्स (सीडी 45), माइलिन की हानि, और घायल अक्षतंतु (एसएमआई -32) की संख्या को निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान किए जाते हैं। रीढ़ की हड्डी में ल्यूकोसाइट्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को मस्तिष्क में ल्यूकोसाइट्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।
मस्तिष्क में अक्षीय हानि और चोट का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन रीढ़ की हड्डी की तुलना में तुलनात्मक रूप से अधिक कठिन है क्योंकि मस्तिष्क के सफेद पदार्थ एक दूसरे के समानांतर नहीं चलते हैं। सीरम न्यूरोफिलामेंट लाइट (एसएफएन-एल) का माप एमएस20,21 में न्यूरोनल चोट के लिए एक आशाजनक बायोमार्कर के रूप में उभरा है। हाल के अध्ययनों ने इस तकनीक को ईएई 22,23,24 तक बढ़ा दिया है। यहां, एक छोटे अणु परख (SIMOA) परख का उपयोग करके जीवित चूहों में सीरम न्यूरोफिलामेंट लाइट (sNF-L) को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। इस विधि सीरम की केवल एक छोटी मात्रा की आवश्यकता है और केवल आधे दिन में जीवित चूहों में किया जा सकता है, कैसे एक परीक्षण चिकित्सा समग्र सीएनएस चोट को प्रभावित कर रहा है पर तेजी से प्रतिक्रिया प्रदान करना. यहां वर्णित सभी विधियों को किसी भी लिंग या तनाव के चूहों पर लागू किया जा सकता है।
रीढ़ की हड्डी का हिस्टोलॉजिकल धुंधला हो जाना ईएई रोग की गंभीरता का आकलन करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण है, खासकर ऐसे उदाहरणों में जहां रोग के बाद के तीव्र चरण में रोग की वसूली की सीमा में उपचार समूहों के बीच मतभेद हैं। प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ (सीडी 45), माइलिन (एलएफबी) और अक्षीय चोट (एसएमआई -32) के लिए धुंधला चूहों में परिवर्तित नैदानिक स्कोर के अंतर्निहित कारण को चिह्नित करने में मदद करता है। यहाँ वर्णित हिस्टोलॉजिकल धुंधला प्रोटोकॉल सूजन के साथ-साथ माइलिन और एक्सोनल चोट की सीमा का एक परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है। इसके अलावा, दिखाए गए परिणाम ईएई में समग्र न्यूरोनल क्षति की सीमा का आकलन करने के लिए एक विधि के रूप में एसएफएन-एल माप को मान्य करते हैं।
इस विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों जांचकर्ताओं वर्गों की पहचान करने के लिए अंधा कर रहे हैं और विभिन्न चूहों भर में रीढ़ की हड्डी के प्रत्येक स्तर पर बराबर नमूना है कि सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं. ऐसा इसलिए है क्योंकि कॉर्ड के निचले स्तर पर सूजन की गंभीरता अधिक हो सकती है। एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर प्रयोगात्मक समूहों का आकार है। रीढ़ की हड्डी और दिमाग आमतौर पर समापन बिंदु पर प्रति समूह 6-8 चूहों से काटा जाता है ताकि मामूली प्रभाव आकार वाले उपचार या जीनोटाइप वाले समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर देखा जा सके। यह भी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चयनित चूहों, जब औसत, पूरे समूह के प्रतिनिधि मतलब स्कोर है. समस्या शूटिंग के बारे में, प्रोटोकॉल के साथ अनुभवहीन लोगों द्वारा सामना की जाने वाली एक आम समस्या यह है कि रीढ़ की हड्डी को अपर्याप्त लंबाई के लिए तय किया जाता है और इसे रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से आसानी से बाहर नहीं निकाला जाता है। यदि यह मामला है, तो रीढ़ की हड्डी को ठीक कैंची का उपयोग करके स्पिनस प्रक्रियाओं के साथ क्लिपिंग करके और रीढ़ की हड्डी को प्रकट करने के लिए स्तंभ खोलकर कॉलम से मैन्युअल रूप से विच्छेदित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ऊतकों एंटीबॉडी धुंधला हो जाना की सफलता के साथ हस्तक्षेप के बिना कुछ अतिरिक्त दिनों के लिए तय किया जा सकता है. यहां वर्णित एंटीबॉडी क्लोन फॉर्मेलिन में 2 सप्ताह तक तय किए गए ऊतक में काम करते हैं।
रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों को एम्बेड करने के लिए कौशल और अभ्यास की आवश्यकता होती है। यह अनुशंसा की जाती है कि आंखों के लूप पहने जाएं और एम्बेडिंग स्टेशन पर एक दीपक को निर्देशित किया जाए ताकि बेहतर कल्पना की जा सके कि क्या अनुभाग क्रॉस-सेक्शन में या अनुदैर्ध्य खंड में गिर रहे हैं। ग्रॉसिंग के दौरान रीढ़ की हड्डी के टुकड़ों की लंबाई 2 मिमी से कम रखने से उन्हें क्रॉस-सेक्शन में गिरने में मदद मिलेगी। कम अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए एक और आम समस्या यह है कि एलएफबी रात भर के इनक्यूबेशन के दौरान वाष्पित हो जाता है, जिससे स्लाइड का आधा हिस्सा दाग जाता है और आधा बेदाग रह जाता है। वाष्पीकरण से बचने के लिए, ग्लास धुंधला पकवान थर्माप्लास्टिक फिल्म और फिर प्लास्टिक की चादर के साथ सील किया जाना चाहिए। यदि वाष्पीकरण होता है और वर्गों असमान दाग रहे हैं, यह पूरी तरह से लिथियम कार्बोनेट के साथ स्लाइड डी-ब्लू और रात भर LFB में उन्हें फिर से दाग करने के लिए सिफारिश की है. एक और आम समस्या यह है कि उपयोगकर्ता LFB के बाद ग्रे मैटर को पूरी तरह से डी-ब्लू नहीं करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत अलग-अलग वर्गों की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल में अन्य चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले पर्याप्त मात्रा में डी-ब्ल्यूइंग पहुंच गया है। इसके अलावा, हालांकि CD45 और SMI-32 IHC दाग मजबूती से प्रदर्शन करते हैं, फिर भी प्राप्त प्रत्येक नए एंटीबॉडी लॉट के लिए प्रारंभिक प्रयोगों में एंटीबॉडी सांद्रता को शूट करना महत्वपूर्ण है। यह एक सकारात्मक नियंत्रण अनुभाग (ईएई रीढ़ की हड्डी) पर एंटीबॉडी की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके किया जा सकता है। पहली बार धुंधला भी एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल होना चाहिए जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी शामिल हैं। अंत में, छवि विश्लेषण में अलग-अलग छवियों को थ्रेसहोल्ड करना महत्वपूर्ण है क्योंकि धुंधला स्लाइड या अनुभागों में असमान हो सकता है।
यह प्रोटोकॉल स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है। यदि किसी के पास प्रोसेसर, एम्बेडर या माइक्रोटोम तक पहुंच नहीं है, तो इन चरणों को अस्पताल-आधारित पैथोलॉजी कोर से प्राप्त किया जा सकता है जो इन सेवाओं की पेशकश करता है। इसके अलावा, अगर किसी के पास स्लाइड स्कैनर तक पहुंच नहीं है, तो कोई एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सकता है जो रीढ़ की हड्डी या मस्तिष्क क्षेत्रों की टीआईएफएफ छवियों को बचाने के लिए एक वीडियो कैमरा के साथ फिट है। माइक्रोस्कोप-आधारित वर्कफ़्लो के लिए, कम शक्ति (40x आवर्धन) पर LFB या LFB/H&E अनुभागों को कैप्चर करें और CD45 और SMI-32 धुंधला हो जाना के लिए, कम से कम चार विंडो जो उदर, पृष्ठीय और रीढ़ की हड्डी के पार्श्व भागों में केंद्रित हैं (CD45 के लिए 200x आवर्धन और SMI-32 के लिए 400x आवर्धन)। छवि विश्लेषण इन छवियों पर किया जा सकता है के रूप में वर्णित तरीके से एक समान तरीके से मात्रा निर्धारित करने के लिए.
ईएई स्कोर करने के लिए क्या हिस्टोलॉजिकल दृष्टिकोण लेने का निर्णय इस बात पर निर्भर करता है कि समूहों के बीच नैदानिक स्कोर कितना भिन्न होता है। उदाहरण के लिए, यदि ईएई नैदानिक स्कोर में भारी अंतर हैं (एक समूह को ईएई मिला और एक को नहीं), तो यह आमतौर पर परिधीय-मध्यस्थता सूजन में अंतर से संबंधित है। इस मामले में, एलएफबी/एच&ई-दाग वाले वर्गों पर डिमाइलेटिंग घावों की उपस्थिति के लिए स्कोरिंग पर्याप्त है और समूहों के बीच अंतर प्रकट करेगा। यदि समूह शुरुआत में नैदानिक स्कोर में अधिक समान होते हैं और नैदानिक वसूली (जैसे चित्रा 5 ए में प्रयोग) की सीमा में अंतर होते हैं, तो मस्तिष्क स्टेम और सेरिबैलम में मस्तिष्क की सूजन के स्कोरिंग सहित यहां उल्लिखित पूर्ण हिस्टोलॉजिकल वर्कफ़्लो को लागू करना सबसे अच्छा है, यह भेद करने के लिए कि क्या रोग जीर्णता के अंतर सूजन या ऊतक क्षति में अंतर से संबंधित हैं। यदि सीडी 45 गिनती द्वारा मूल्यांकन के रूप में सूजन में अंतर पाया जाता है, तो टी कोशिकाओं (एंटी-सीडी 3), घुसपैठ मोनोसाइट / मैक्रोफेज (मैक 3) और माइक्रोग्लिया (आईबीए -1 / TMEM119) (अनुशंसित एंटीबॉडी क्लोन पूरक तालिका 3 में हैं) के लिए दाग के लिए आगे आईएचसी अध्ययन किया जा सकता है। माइक्रोग्लिया सक्रियण डबल-लेबल वाले इबा-1 + टीएमईएम –19 + माइक्रोग्लिया पर आईबीए -1 धुंधला की तीव्रता में वृद्धि और माइक्रोग्लिया प्रक्रियाओं की वृद्धि हुई वापसी से परिलक्षित होता है जिसका मूल्यांकन धारा32 पर शॉल विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री या एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण जैसी तकनीकों को मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में प्रतिरक्षा आबादी की आवृत्ति और फेनोटाइप के गहन लक्षण वर्णन का संचालन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
SMI-32+ अक्षतंतु की गिनती EAE 32,33 और MS34 में अक्षतंतु की चोट का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील विधि है। एसएमआई -32, जो भारी या मध्यम न्यूरोफिलामेंट के गैर-फॉस्फोराइलेटेड रूप का पता लगाता है, ट्रांसेक्ट न्यूरॉन्स के अंत-बल्बों में जमा होता है। घायल अक्षतंतु का पता लगाने के लिए एक विकल्प अमाइलॉइड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) के साथ दाग है जो बाधित अक्षतंतु परिवहन33 के परिणामस्वरूप अक्षतंतु में जमा हो सकता है। एसएमआई -32 और एपीपी के लिए धुंधला होने का पैटर्न हालांकि दोनों अक्षतंतु की चोट के चिंतनशील हैं, आम तौर पर ओवरलैप नहीं करते हैं, यह दर्शाता है कि वे विभिन्न विकृति33 का पता लगा रहे हैं। एक एसएएनएफ-एल को मापकर अक्षतंतु की चोट के हिस्टोलॉजिकल उपायों को भी पूरक कर सकता है, जो रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क दोनों में चल रही अक्षीय चोट का एक तेज़ और संवेदनशील उपाय है। यह लाभ प्रदान करता है कि यह जीवित चूहों में आधे दिन में किया जा सकता है। इस पद्धति का एक दोष यह है कि किट महंगे हैं और मशीन अत्यधिक विशिष्ट है। एसएफएन-एल किट बेचने वाली कंपनी उन लोगों के लिए सेवा के लिए शुल्क की पेशकश करती है जिनके पास सिमोआ मशीन तक पहुंच नहीं है। अक्षतंतु की चोट का आकलन करने का एक विकल्प रीढ़ की हड्डी12 के टोलुइडीन ब्लू-दाग वाले वर्गों में अक्षतंतु की गिनती करके या रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ32 के क्षेत्रों में एसएमआई -31 द्वारा पता लगाए गए न्यूरोफिलामेंट बंडलों की गिनती करके अक्षतंतु हानि के लिए स्कोर करना है। ये दोनों एसएमआई -32 या एसएफएन-एल माप की तुलना में अधिक श्रमसाध्य दृष्टिकोण हैं।
यदि ईएई नैदानिक स्कोर समूहों के बीच भिन्न होते हैं, लेकिन सूजन, डिमाइलिनेशन और एक्सोनल चोट के लिए स्कोरिंग समूहों के बीच अंतर प्रकट नहीं करता है, तो जीएफएपी का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट सक्रियण के लिए दाग उपयोगी हो सकता है (अनुशंसित एंटीबॉडी क्लोन के लिए पूरक तालिका 3 देखें)। एस्ट्रोसाइट सक्रियण जीएफएपी धुंधला में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और इसे डीए चूहे35 में क्रोनिक ईएई सहित कुछ ईएई मॉडल में ईएई प्रगति के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल तरीकों का वर्णन करता है और ईएई के हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग का संचालन करने के लिए एक विश्लेषण वर्कफ़्लो प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
रेमंड सोबेल (स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी) को हमें मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के वर्गों को सकल करने और ठीक करने की अपनी विधि दिखाने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम काइल रॉबर्टन और मिलान गांगुली को टोरंटो सेंटर फॉर फेनोजेनोमिक्स से एम्बेडिंग विधि सीखने और हमारे मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के कई हिस्सों को काटने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम रीढ़ की हड्डी में सबमेनिंगियल और पेरिवास्कुलर सूजन स्कोर करने के लिए अपने प्रोटोकॉल साझा करने के लिए डॉ मैथ्यू कुसिक और डॉ रॉबर्ट फुजिनामी (यूटा विश्वविद्यालय) का धन्यवाद करते हैं। हम सीडी 45 एंटीबॉडी के क्लोन को साझा करने के लिए शालिना उस्मान को धन्यवाद देते हैं। हम ऊतक प्रोसेसर और ऊतक एम्बेडिंग स्टेशन पर प्रशिक्षण और सेंट माइकल अस्पताल में बायोमेडिकल रिसर्च के कीनन रिसर्च सेंटर में इस उपकरण को बनाए रखने के लिए Xiofang लू धन्यवाद. इस काम को एमएस कनाडा (एसईडी के लिए) से बायोमेडिकल अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। कारमेन Ucciferri कनाडा सरकार से एक छात्र द्वारा समर्थित है। नूरिया Alvarez-सांचेज़ एक कीनन के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |