Fibertypeidentifikasjon av menneskelig skjelettmuskulatur

Summary

Denne protokollen demonstrerer enkeltfiberisolasjon fra frysetørket human skjelettmuskulatur og fibertypeklassifisering i henhold til Myosin heavy chain (MHC) isoform ved bruk av prikkblottingsteknikken. Identifiserte MHC I og II fiberprøver kan deretter analyseres videre for fibertypespesifikke forskjeller i proteinuttrykk ved bruk av vestlig blotting.

Abstract

Teknikken beskrevet her kan brukes til å identifisere spesifikke myosin heavy chain (MHC) isoformer i segmenter av individuelle muskelfibre ved hjelp av dot blotting, heretter referert til som Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Denne protokollen beskriver prosessen med frysetørking av menneskelig skjelettmuskulatur og isolering av segmenter av enkeltmuskelfibre. Ved bruk av MyDoBID klassifiseres type I- og II-fibre med henholdsvis MHCI- og IIa-spesifikke antistoffer. Klassifiserte fibre blir deretter kombinert i fibertypespesifikke prøver for hver biopsi.

Det totale proteinet i hver prøve bestemmes av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og UV-aktivert gelteknologi. Fibertypen av prøver valideres ved hjelp av vestlig blotting. Viktigheten av å utføre normalisering av proteinbelastning for å forbedre målproteindeteksjon over flere vestlige flekker er også beskrevet. Fordelene ved å konsolidere klassifiserte fibre i fibertypespesifikke prøver sammenlignet med enkeltfiber vestlige blots, inkluderer prøveallsidighet, økt prøvegjennomstrømning, kortere tidsinvestering og kostnadsbesparende tiltak, samtidig som verdifull fibertypespesifikk informasjon som ofte overses ved hjelp av homogeniserte muskelprøver. Formålet med protokollen er å oppnå nøyaktig og effektiv identifisering av type I- og type II-fibre isolert fra frysetørkede humane skjelettmuskelprøver.

Disse individuelle fibrene blir deretter kombinert for å lage type I og type II fibertypespesifikke prøver. Videre er protokollen utvidet til å omfatte identifisering av type IIx-fibre, ved bruk av aktin som markør for fibre som var negative for MHCI og MHCIIa, som er bekreftet som IIx-fibre ved vestlig blotting. Hver fibertypespesifikk prøve brukes deretter til å kvantifisere uttrykket av forskjellige målproteiner ved hjelp av vestlige blottingsteknikker.

Introduction

Skjelettmuskulatur er et heterogent vev, med distinkte cellulære metabolske og kontraktile egenskaper som er avhengig av om cellen (fiber) er langsom rykk (type I) eller rask rykning (type II). Fibertypen kan identifiseres ved å undersøke isoformene myosin heavy chain (MHC), som avviger fra hverandre på flere måter, inkludert sammentrekningstid, forkortelseshastighet og utmattelsesmotstand¹. Store MHC-isoformer inkluderer type I, type IIa, type IIb og type IIx, og deres metabolske profiler er enten oksidative (type I og IIa) eller glykolytiske (IIx, IIb)¹. Andelen av disse fibertypene varierer i muskeltype og mellom arter. Type IIb er mye funnet i gnagermuskel. Menneskelige muskler inneholder ingen type IIb-fibre og består hovedsakelig av MHC-isoformer type I- og IIa-fibre, med en liten andel IIx-fibre². Proteinuttrykksprofiler varierer mellom forskjellige fibertyper og kan endres med aldring³, øvelse ^4,5 og sykdom⁶.

Måling av cellulære responser i forskjellige skjelettmuskelfibertyper blir ofte oversett eller ikke mulig på grunn av undersøkelse av muskelhomogenater (en blanding av alle fibertyper). Single-fiber western blot tillater undersøkelse av flere proteiner i individuelle muskelfibre⁷. Denne metoden har tidligere blitt brukt til å produsere nye og informative enkeltfiberegenskaper som ikke var mulig å oppnå ved bruk av homogenatpreparater. Imidlertid er det noen begrensninger i den opprinnelige single-fiber western blot-metoden, inkludert den tidkrevende naturen, manglende evne til å generere prøvereplikater og bruk av dyre, følsomme forbedrede kjemiluminescensreagenser (ECL). Hvis ferskt vev brukes, er denne metoden ytterligere begrenset på grunn av tidsbegrensningene for å måtte isolere individuelle fibre innen en begrenset tidsramme (dvs. 1-2 timer). Heldigvis reduseres denne begrensningen ved å isolere enkeltfibersegmenter fra frysetørket vev⁸. Imidlertid er fiberinnsamling fra frysetørkede prøver begrenset av størrelsen og kvaliteten på det biopsierte vevet.

Fibertypeidentifikasjon ved hjelp av punktblottingsmetoden⁹ har blitt betydelig utdypet og utvidet i denne omfattende protokollen. Tidligere har det blitt vist at så lite som ~ 2-10 mg våtvekt muskelvev er tilstrekkelig for frysetørking og enkeltfiber MHC isoform proteinanalyse⁹. Christensen et ^al.9 brukte 30% av et ~ 1 mm fibersegment for å oppdage MHC-isoformen tilstede ved prikkblotting, som ble bekreftet av vestlig blotting. Dette arbeidet viste at ved å erstatte vestlig blotting med prikkblotting, ble de totale kostnadene redusert med ~ 40 ganger (for 50 fibersegmenter). Fibre ble deretter “samlet” i type I og type II prøver, som tillot eksperimentell replikasjon⁹. Likevel var en begrensning at bare to fibertypespesifikke prøver ble oppnådd: type I (MHCI positiv) og type II (MHCII positive fibre), med type II-prøver som inneholdt en blanding av MHCIIa og MHCIIx ^6,10. Spesielt demonstrerer den nåværende protokollen hvordan rene type IIx-fibre kan identifiseres og gir en svært detaljert arbeidsflyt (oppsummert i figur 1), inkludert feilsøkingsstrategier for vanlige protokollproblemer.

Protocol

Humane muskelprøver ble tatt fra vastus lateralis fra n = 3 (2 menn, 1 kvinne), i alderen 70-74 år under sterile forhold ved bruk av lokalbedøvelse (Xylocaine) og en Bergstrom nål modifisert for manuell suging11,12. Prøvene var en undergruppe av en tidligere studie godkjent av Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) og utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen13. Deltakerne ga skriftlig, informert …

Representative Results

Identifisering av individuelle MHCI-, MHCIIa- og MHCIIx-muskelfibre ved bruk av prikkblottingEt trekk ved MyDoBID er kategoriseringen av den varierende MHC- og aktinsignalintensitetsstyrken i en gitt fiber (figur 4A). Fibertype ble identifisert ved tilstedeværelse eller fravær av MHCI- og IIa-isoformer (figur 4B). Seks fibre viste ingen MHC- eller aktindeteksjon, noe som indikerte at det ikke var oppsamlet fiber. Resultatene av denne spesi…

Discussion

Fiber samling
Basert på flere års erfaring kan de fleste forskere mestre denne teknikken; Praksis fører imidlertid til raskere og mer effektiv fiberinnsamling for nedstrømsanalyser. For å kunne isolere 30 enkeltfibersegmenter av en kvalitet for sammenslåing, anbefales det at det samles inn 50 fibersegmenter per prøve. Det anbefales å studere fiberinnsamlingsvideoen nøye og etter å ha utført to treningsøkter (~ 50 fibre per økt) for å oppnå en rimelig standard. Alle innsamlede fibre gjen…

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.