Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

Summary

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

Abstract

A técnica aqui descrita pode ser usada para identificar isoformas específicas da cadeia pesada de miosina (MHC) em segmentos de fibras musculares individuais usando dot blotting, doravante referido como detecção de cadeia pesada de Myosin por Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Este protocolo descreve o processo de liofilização do músculo esquelético humano e o isolamento de segmentos de fibras musculares únicas. Usando MyDoBID, as fibras do tipo I e II são classificadas com anticorpos MHCI- e IIa-específicos, respectivamente. As fibras classificadas são então combinadas em amostras específicas do tipo de fibra para cada biópsia.

A proteína total em cada amostra é determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e tecnologia de gel ativado por UV. O tipo de fibra das amostras é validado usando western blotting. A importância de realizar a normalização da carga proteica para melhorar a detecção de proteínas-alvo em vários western blots também é descrita. Os benefícios da consolidação de fibras classificadas em amostras específicas do tipo de fibra em comparação com as blots ocidentais de fibra única incluem versatilidade da amostra, maior rendimento da amostra, menor investimento de tempo e medidas de economia de custos, tudo isso enquanto retém informações valiosas específicas do tipo de fibra que são frequentemente negligenciadas usando amostras musculares homogeneizadas. O objetivo do protocolo é obter a identificação precisa e eficiente de fibras tipo I e tipo II isoladas de amostras de músculo esquelético humano liofilizado.

Essas fibras individuais são posteriormente combinadas para criar amostras específicas do tipo I e do tipo II de fibras. Além disso, o protocolo é estendido para incluir a identificação de fibras do tipo IIx, usando Actina como marcador para fibras negativas para MHCI e MHCIIa, que são confirmadas como fibras IIx por western blotting. Cada amostra específica do tipo de fibra é então usada para quantificar a expressão de várias proteínas-alvo usando técnicas de western blotting.

Introduction

O músculo esquelético é um tecido heterogêneo, com propriedades metabólicas e contráteis celulares distintas que dependem se a célula (fibra) é de contração lenta (tipo I) ou contração rápida (tipo II). O tipo de fibra pode ser identificado examinando-se as isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC), que diferem entre si de várias maneiras, incluindo tempo de contração, velocidade de encurtamento e resistência à fadiga¹. As principais isoformas de MHC incluem tipo I, tipo IIa, tipo IIb e tipo IIx e seus perfis metabólicos são oxidativos (tipo I e IIa) ou glicolíticos (IIx, IIb)¹. A proporção desses tipos de fibras varia no tipo muscular e entre as espécies. O tipo IIb é amplamente encontrado no músculo de roedores. A musculatura humana não contém fibras do tipo IIb e é constituída predominantemente pelas isoformas MHC do tipo I e IIa, com pequena proporção de fibras IIx². Os perfis de expressão proteica variam entre os diferentes tipos de fibras e podem ser alterados com o envelhecimento³, exercício ^4,5 e doença 6.

A medição das respostas celulares em diferentes tipos de fibras musculares esqueléticas é frequentemente negligenciada ou não é possível devido ao exame de homogeneizados musculares (uma mistura de todos os tipos de fibras). O western blot de fibra única permite a investigação de múltiplas proteínas em fibras musculares individuais⁷. Esta metodologia foi previamente utilizada para produzir características novas e informativas de monofibra que não foram possíveis de obter usando preparações homogeneizadas. No entanto, existem algumas limitações da metodologia original de western blot de fibra única, incluindo a natureza demorada, a incapacidade de gerar réplicas de amostra e o uso de reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) caros e sensíveis. Se o tecido fresco está sendo usado, este método é ainda mais limitado devido às restrições de tempo da necessidade de isolar fibras individuais dentro de um período de tempo limitado (ou seja, 1-2 h). Felizmente, essa restrição é atenuada pelo isolamento de segmentos monofibrosos do tecido liofilizado⁸. No entanto, a coleta de fibras de amostras liofilizadas é limitada pelo tamanho e qualidade do tecido biopsiado.

A identificação do tipo de fibra usando o método dot blotting⁹ foi significativamente elaborada e expandida neste protocolo abrangente. Previamente, foi demonstrado que apenas ~2-10 mg de tecido muscular de peso úmido é adequado para liofilização e análise de proteína de isoforma MHC de fibra única⁹. Christensen et ^al.9 utilizaram 30% de um segmento de fibra de ~1 mm para detectar a isoforma MHC presente por dot blotting, o que foi confirmado por western blotting. Este trabalho mostrou que, ao substituir o western blotting pelo dot blotting, os custos totais foram reduzidos em ~40 vezes (para 50 segmentos de fibra). As fibras foram então “agrupadas” em amostras do tipo I e tipo II, o que permitiu a replicação experimental⁹. No entanto, uma limitação foi que apenas duas amostras específicas do tipo de fibra foram obtidas: tipo I (MHCI positivo) e tipo II (MHCII positivo), com amostras do tipo II contendo uma mistura de MHCIIa e MHCIIx ^6,10. Notavelmente, o protocolo atual demonstra como as fibras do tipo IIx puras podem ser identificadas e fornece um fluxo de trabalho altamente detalhado (resumido na Figura 1), incluindo estratégias de solução de problemas para problemas comuns de protocolo.

Protocol

Amostras de músculo humano foram obtidas do vasto lateral de n = 3 (2 homens, 1 mulher), com idade entre 70 e 74 anos, em condições estéreis, utilizando-se anestesia local (xilocaína) e agulha de Bergstrom modificada para sucção manual11,12. As amostras foram um subconjunto de um estudo prévio aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Victoria University (HRETH11/221) e conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque<sup class="…

Representative Results

Identificação de fibras musculares MHCI, MHCIIa e MHCIIx individuais usando dot blottingUma característica do MyDoBID é a categorização da variação da intensidade de sinal MHC e Actina em uma dada fibra (Figura 4A). O tipo de fibra foi identificado pela presença ou ausência das isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras não apresentaram detecção de MHC ou actina, indicando que não houve coleta de fibras. Os resultados desse …

Discussion

Coleção de fibras
Com base em vários anos de experiência, a maioria dos pesquisadores pode dominar essa técnica; no entanto, a prática leva a uma coleta de fibra mais rápida e eficiente para análises a jusante. Para poder isolar 30 segmentos de fibra única de qualidade para pooling, recomenda-se que sejam coletados 50 segmentos de fibra por amostra. Estudar o vídeo de coleta de fibras cuidadosamente e depois de realizar duas sessões de prática (~50 fibras por sessão) é recomendado para a…

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.