Detta protokoll demonstrerar isolering av enstaka fibrer från frystorkad mänsklig skelettmuskulatur och fibertypsklassificering enligt isoform av Myosin heavy chain (MHC) med hjälp av dot blotting-tekniken. Identifierade MHC I- och II-fiberprover kan sedan analyseras ytterligare för fibertypsspecifika skillnader i proteinuttryck med hjälp av western blotting.
Tekniken som beskrivs här kan användas för att identifiera specifika isoformer av tunga myosinkedjor (MHC) i segment av enskilda muskelfibrer med hjälp av punktblotting, hädanefter kallad Myosin heavy chain detection genom Dot B-lottningför ID-entifieringav muskelfibertyp (MyDoBID). Detta protokoll beskriver processen att frystorka mänsklig skelettmuskulatur och isolera segment av enstaka muskelfibrer. Med hjälp av MyDoBID klassificeras typ I- och II-fibrer med MHCI- respektive IIa-specifika antikroppar. Klassificerade fibrer kombineras sedan till fibertypspecifika prover för varje biopsi.
Det totala proteinet i varje prov bestäms av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och UV-aktiverad gelteknik. Fibertypen av prover valideras med hjälp av western blotting. Vikten av att utföra normalisering av proteinbelastning för att förbättra detektionen av målproteiner över flera västerländska fläckar beskrivs också. Fördelarna med att konsolidera klassificerade fibrer till fibertypsspecifika prover jämfört med enfiberiga western blots, inkluderar provmångsidighet, ökad provgenomströmning, kortare tidsinvestering och kostnadsbesparande åtgärder, samtidigt som värdefull fibertypspecifik information som ofta förbises med hjälp av homogeniserade muskelprover. Syftet med protokollet är att uppnå noggrann och effektiv identifiering av typ I- och typ II-fibrer isolerade från frystorkade mänskliga skelettmuskelprover.
Dessa enskilda fibrer kombineras sedan för att skapa typ I- och typ II-fibertypspecifika prover. Dessutom utvidgas protokollet till att omfatta identifiering av typ IIx-fibrer, med aktin som markör för fibrer som var negativa för MHCI och MHCIIa, vilka bekräftas som IIx-fibrer genom western blotting. Varje fibertypsspecifikt prov används sedan för att kvantifiera uttrycket av olika målproteiner med hjälp av western blotting-tekniker.
Skelettmuskulatur är en heterogen vävnad, med distinkta cellulära metaboliska och kontraktila egenskaper som är beroende av om cellen (fibern) är långsam ryckning (typ I) eller snabb ryckning (typ II). Fibertypen kan identifieras genom att undersöka isoformerna av myosin tung kedja (MHC), som skiljer sig från varandra på flera sätt, inklusive kontraktionstid, förkortningshastighet och utmattningsbeständighet1. Viktiga MHC-isoformer inkluderar typ I, typ IIa, typ IIb och typ IIx och deras metaboliska profiler är antingen oxidativa (typ I och IIa) eller glykolytiska (IIx, IIb)1. Andelen av dessa fibertyper varierar i muskeltyp och mellan arter. Typ IIb finns ofta i gnagarmuskulaturen. Mänskliga muskler innehåller inga typ IIb-fibrer och består huvudsakligen av MHC-isoformer typ I- och IIa-fibrer, med en liten andel IIx-fibrer2. Proteinuttrycksprofilerna varierar mellan olika fibertyper och kan förändrasmed 3 års ålder, träning 4,5 och sjukdom6.
Att mäta cellulära svar i olika typer av skelettmuskelfibrer förbises ofta eller är inte möjligt på grund av undersökningen av muskelhomogenat (en blandning av alla fibertyper). Enkelfibervästlig fläck gör det möjligt att undersöka flera proteiner i enskilda muskelfibrer7. Denna metodik har tidigare använts för att producera nya och informativa enkelfiberegenskaper som inte var möjliga att erhålla med homogena preparat. Det finns dock vissa begränsningar med den ursprungliga enkelfiber-western blot-metoden, inklusive den tidskrävande karaktären, oförmågan att generera provreplikat och användningen av dyra, känsliga ECL-reagenser (Enhanced Chemiluminescence). Om färsk vävnad används är denna metod ytterligare begränsad på grund av tidsbegränsningarna för att behöva isolera enskilda fibrer inom en begränsad tidsram (dvs. 1-2 timmar). Lyckligtvis mildras denna återhållsamhet genom att isolera enfibersegment från frystorkad vävnad8. Fiberinsamlingen från frystorkade prover begränsas dock av storleken och kvaliteten på den biopsierade vävnaden.
Identifiering av fibertyp med hjälp av dot blotting-metoden9 har utvecklats avsevärt och utökats i detta omfattande protokoll. Tidigare har det visats att så lite som ~2-10 mg våt muskelvävnad är tillräcklig för frystorkning och enfiberig MHC-isoformproteinanalys9. Christensen et al.9 använde 30 % av ett ~1 mm fibersegment för att detektera MHC-isoformen som finns vid punktblotting, vilket bekräftades genom western blotting. Detta arbete visade att genom att ersätta western blotting med dot blotting minskade de totala kostnaderna med ~40 gånger (för 50 fibersegment). Fibrerna “poolades” sedan i typ I- och typ II-prover, vilket möjliggjorde experimentell replikering9. En begränsning var dock att endast två fibertypsspecifika prover erhölls: typ I (MHCI-positiva) och typ II (MHCII-positiva fibrer), med typ II-prover som innehöll en blandning av MHCIIa och MHCIIx 6,10. Det nuvarande protokollet visar hur rena typ IIx-fibrer kan identifieras och ger ett mycket detaljerat arbetsflöde (sammanfattat i figur 1), inklusive felsökningsstrategier för vanliga protokollproblem.
Insamling av fibrer
Baserat på flera års erfarenhet kan de flesta forskare behärska denna teknik; Övning leder dock till snabbare och effektivare fiberinsamling för nedströmsanalyser. För att kunna isolera 30 enkelfibersegment av en kvalitet för poolning, rekommenderas att 50 fibersegment samlas in per prov. Att studera fiberinsamlingsvideon noggrant och efter att ha utfört två övningssessioner (~50 fibrer per session) rekommenderas för att uppnå en rimlig standard. Alla fibrer som samlas…
The authors have nothing to disclose.
Antikropparna mot MHC I (A4.840) och MHCIIa (A4.74) som användes i denna studie utvecklades av Dr. H. M. Blau och antikroppen mot MHCIIx (6H1) utvecklades av Dr. C. A. Lucas och erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), tack vare överinseende av National Institute of Child Health and Human Development och underhålls av University of Iowa, Institutionen för biologiska vetenskaper (Iowa City, IA). Vi tackar Victoria L. Wyckelsma för att ha tillhandahållit de mänskliga muskelproverna för denna studie. Majoriteten av bilderna i figur 1 kommer från BioRender.com.
Finansiering:
Denna studie fick ingen extern finansiering.
1x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies | 1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C. |
3x Denaturing buffer | Make according to recipe | Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors | 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8. Store at -20 °C. |
95% Ethanol | N/A | 100% ethanol can be sourced from any company | Diluted to 95% with ultra-pure H2O. |
Actin rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | A2066 | Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer. |
Analytical scales | Mettler Toledo | Model number: MSZ042101 | |
Antibody enhancer | Thermo Fischer Scientific | 32110 | Product name is Miser Antibody Extender Solution NC. |
Beaker (100 mL) | N/A | N/A | |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5452 | Model name: Mini Spin. |
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. | Diploma | Store bought | |
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 | BSA: Sigma-Aldrich PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich | BSA: A6003-25G 10x PBS: 1610780 NaN3: S2002 | Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C. |
Cassette opening lever | Bio-Rad Laboratories | 4560000 | Used to open the precast gel cassettes. |
Chemidoc MP Imager | Bio-Rad Laboratories | Model number: Universal hood III | Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities. |
Criterion blotter | Bio-Rad Laboratories | 1704070 | Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables. |
Criterion Cell (Bio-Rad) | Bio-Rad Laboratories | 1656001 | |
ECL (enhanced chemiluminescence) | Bio-Rad Laboratories | 1705062 | Product name: Clarity Max Western ECL Substrate. |
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) | Bio-Rad Laboratories | 1610772 | Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O. |
Filter paper, 0.34 mm thick | Whatmann | 3030917 | Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm. |
Fine tissue dissecting forceps | Dumont | F6521-1EA | Jeweller’s forceps no. 5. |
Flat plastic tray/lid | N/A | N/A | Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat. |
Freeze-drying System | Labconco | 7750030 | Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage. |
Freezer -80 oC | N/A | N/A | Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable. |
Gel releasers | 1653320 | Bio-Rad | Slide under the membrane to gather or move the membrane. |
Grey lead pencil | N/A | N/A | |
Image lab software | Bio-Rad Laboratories | N/A | Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used. |
Incubator | Bio-Rad Laboratories | 1660521 | Any incubator that can be set to 37 °C would suffice. |
Lamp | N/A | N/A | |
Magnetic stirrer with flea | N/A | N/A | |
Membrane roller | Bio-Rad Laboratories | 1651279 | Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. |
Microcentrifuge tubes (0.6 mL) | N/A | N/A | |
Mouse IgG HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31430 | Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer. |
Mouse IgM HRP secondary | Abcam | ab97230 | Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG. |
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody | DSHB | A4.840 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody | DSHB | A4.74 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody | DSHB | 6H1 | Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer. |
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620115 | For Western blotting. |
Petri dish lid | N/A | N/A | |
Plastic tweezers | N/A | N/A | |
Power Pack | Bio-Rad Laboratories | 164-5050 | Product name: Basic power supply. |
Protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa. |
PVDF Membrane 0.2 µm | Bio-Rad Laboratories | 1620177 | |
Rabbit HRP secondary | Thermo Fisher Scientific | 31460 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies. |
Rocker | N/A | N/A | |
Ruler | N/A | N/A | |
Scissors | N/A | N/A | |
Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
Stripping buffer | Thermo Fisher Scientific | 21059 | Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer. |
Tissue (lint free) | Kimberly-Clark professional | 34120 | Product name: Kimwipe. |
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) | TG: Bio-Rad Laboratories Methanol: Merck | TG buffer: 1610771 Methanol: 1.06018 | dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C. |
Transfer tray | Bio-Rad Laboratories | 1704089 | |
UV-activation precast gel | Bio-Rad Laboratories | 5678085 | Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL. |
Vortex | N/A | N/A | |
Wash buffer (1x TBST) | 10x TBS: Astral Scientific Tween 20: Sigma | BIOA0027-4L | 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C. |
Wash containers | Sistema | Store bought | Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice. |