Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.
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Articolo metodologico
Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie neurodegenerative della retina sono le principali cause di cecità. Tra le numerose strategie terapeutiche esplorate, l'autoriparazione stimolante è emersa recentemente come particolarmente attraente. Una fonte cellulare di interesse per la riparazione della retina è la cellula gliale di Müller, che ospita un potenziale di cellule staminali e una straordinaria capacità rigenerativa negli anamnioti. Questo potenziale è, tuttavia, molto limitato nei mammiferi. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione retinica in modelli animali con capacità rigenerative dovrebbe fornire informazioni su come sbloccare la capacità latente delle cellule di Müller dei mammiferi di rigenerare la retina. Si tratta di un passo fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa. A questo scopo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di danno retinico in Xenopus: una lesione retinica meccanica, una linea transgenica che consente l'ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi, un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e un modello citotossico guidato da iniezioni intraoculari di CoCl2 . Evidenziandone i vantaggi e gli svantaggi, descriviamo qui questa serie di protocolli che generano varie condizioni degenerative e permettono lo studio della rigenerazione retinica in Xenopus.
Introduzione
Milioni di persone in tutto il mondo sono afflitte da varie malattie degenerative della retina che portano alla cecità, come la retinite pigmentosa, la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Ad oggi, queste condizioni rimangono in gran parte incurabili. Gli attuali approcci terapeutici in fase di valutazione includono la terapia genica, i trapianti di cellule o tessuti, i trattamenti neuroprotettivi, l'optogenetica e i dispositivi protesici. Un'altra strategia emergente si basa sull'auto-rigenerazione attraverso l'attivazione di cellule endogene con potenziale di cellule staminali. Le cellule gliali di Müller, il principale tipo di cel....
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Protocollo
La cura degli animali e la sperimentazione sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali, nell'ambito della licenza istituzionale A91272108. I protocolli di studio sono stati approvati dal comitato istituzionale per la cura degli animali CEEA #59 e hanno ricevuto l'autorizzazione dalla Direction Départementale de la Protection des Populations con il numero di riferimento APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questi protocolli.
1. Lesione meccanica d....
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Risultati
Lesione meccanica della retina
Le sezioni retiniche dei girini sottoposti alla lesione meccanica descritta nella sezione 1 del protocollo mostrano che la lesione retinica comprende tutti gli strati del tessuto pur rimanendo limitata al sito di puntura (Figura 2A,B).
Ablazione condizionale delle cellule dei bastoncelli con il sistema NTR-MTZ
Gli occhi di girini transgenici Anestetizzati Tg(rho:GFP-NTR)
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Discussione
Vantaggi e svantaggi dei vari paradigmi di lesione retinica nei girini di Xenopus
Lesione meccanica della retina
Varie lesioni chirurgiche della retina neurale sono state sviluppate nei girini di Xenopus. La retina neurale può essere completamente rimossa 15,16 o asportata solo parzialmente16,17. La lesione meccanica qui pr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a M.P. da parte dell'Association Retina France, della Fondation de France, della FMR (Fondation Maladies Rares), della BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e dell'UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in collaborazione con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-Propandiolo (propil... ne glicole) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Etanolo assoluto ≥ 99,8% | Prodotti chimici VWR | 20821-365 | |
| Anticorpo anti-caspasi 3 (coniglio) | Segnalazione cellulare | 9661S | Diluizione 1/300 |
| Anticorpo anti-GFP (pollo) | Aveslabs | GFP-1020 | Diluizione 1/500 |
| Anticorpo anti-M-Opsina (coniglio) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Diluizione 1/500 |
| Anticorpo secondario anti-topo, Alexa Fluor 594 (capra) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Diluizione 1/1.000 |
| Anticorpo anti-Otx2 (coniglio) | Abcam | Ab183951 | Diluizione 1/100 |
| Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 488 (capra) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Diluizione 1/1.000 |
| Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 594 (capra) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Diluizione 1/1.000 |
| Anticorpo anti-Recoverina (coniglio) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Diluizione 1/500 |
| Anticorpo anti-Rodopsina (topo) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Diluizione 1/1.000 |
| Anticorpo Anti-S-Opsina (coniglio) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Diluizione 1/500 |
| Kit di rilevamento Apoptotis (sistema TUNEL fluorimetrico senza uscita) | Promega | G3250 | |
| Benzocaina | Sigma-Aldrich | E1501 | Soluzione madre 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Soluzione madre 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥ 99,5% | Sostanze chimiche VWR | 20810.298 | |
| Cloruro di calcio diidrato (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1,02382 | Utilizzare a 0,1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass modello GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cloruro di cobalto(II) esaidrato (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Soluzione madre 100 mM |
| Vetrino coprioggetti 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluente | Agilent | S202230-2 | |
| dimetilsolfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Microtomo elettronico rotativo | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosina 1% acquosa | RAL Diagnostica | 312740 | |
| Fluoresceina lisina destrano | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Stereomicroscopio fluorescente | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamicina | Euromedex | EU0410-B | |
| Glicerina albumina secondo Mallory | Diapath | E0012 | Utilizzo al 3% in acqua |
| Ematossilina (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES sale | di potassioSigma-Aldrich | H0527 | |
| Ormone gonadotropina corionica umana | MSD Salute animale | Chorulon 1500 | |
| Acido cloridrico fumante, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cisteina cloridrato monoidrato | Sigma-Aldrich | C7880 | Utilizzare al 2% in 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0) |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4, 7H< sub>2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazolo | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Utilizzare a 10 mM |
| Punte per microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Estrattore per micropipette (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Modello P-97 | Programma : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mezzo di montaggio per preservare la fluorescenza, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mezzo di montaggio, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Lama per ultramicrotomo | Epredia | 3053835 | |
| Ago Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Portaspilli nichelato | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Tessuto filtrante in nylon (tessuto setacciante) NITEX, apertura a rete 1.000 &; m | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffina histowax senza DMSO | Histolab | 00403 | |
| Soluzione di paraformaldeide (32%) | Microscopia elettronica | Scienze EM-15714-S Utilizzo | al 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Stampi monouso per inclusione | Epredia | 2219 | |
| Pestello | VWR | 431-0094 | |
| Piastra di Petri 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Piastra di Petri 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| Sistema di microiniezione PicoSpritzer | Prodotti per strumentazione | Parker PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polisaccarosio (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Utilizzare al 3% in 0,1x MBS |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Cibo per avannotti in polvere : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Dissezione a forbice | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Vetro | VS11171076FKA | |
| Riscaldatore per vetrini | Kunz instruments | HP-3 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Citrato di sodio sale trisodico diidrato (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Carbonato acido di sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Idrossido di sodio 30% soluzione acquosa (NaOH) | Sostanze chimiche VWR | 28217-292 | |
| Stereomicroscopio | Siringhe Zeiss | Stemi 2000 | |
| Siringhe monouso Omnifix-F Solo 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| crRNA trans-attivante (tracrRNA) | Tecnologie | DNA integrate | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Illuminatore a fluorescenza | X-Cite | 200DC | |
| Xilene ≥ 98,5% | Prodotti chimici VWR | 28975-325 |
Riferimenti
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of t....
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Ristampe e permessi
