Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Abstract

La rete di microtubuli è una componente essenziale del sistema nervoso. Le mutazioni in molte proteine regolatorie dei microtubuli sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurologiche, come la proteina Tau associata ai microtubuli per le malattie neurodegenerative, la proteina di recisione dei microtubuli Spastin e Katanin 60 causano rispettivamente paraplegia spastica ereditaria e anomalie dello sviluppo neurologico. Il rilevamento di reti di microtubuli nei neuroni è vantaggioso per chiarire la patogenesi dei disturbi neurologici. Tuttavia, le piccole dimensioni dei neuroni e la disposizione densa dei fasci di microtubuli assonali rendono difficile la visualizzazione delle reti di microtubuli. In questo studio, descriviamo un metodo per la dissezione della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari, nonché l'immunocolorazione della α-tubulina e della proteina Futsch associata ai microtubuli per visualizzare le reti di microtubuli in Drosophila melanogaster. La giunzione neuromuscolare ci permette di osservare sia i microtubuli pre che post-sinaptici, e le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. Qui, mutando e sovraesprimendo la Katanina 60 in Drosophila melanogaster, e quindi esaminando le reti di microtubuli nella giunzione neuromuscolare e nelle cellule muscolari, riveliamo accuratamente il ruolo regolatore della Katanina 60 nel neurosviluppo. Pertanto, combinato con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Introduzione

I microtubuli (MT), come uno dei componenti strutturali del citoscheletro, svolgono un ruolo importante in diversi processi biologici, tra cui la divisione cellulare, la crescita e la motilità cellulare, il trasporto intracellulare e il mantenimento della forma cellulare. La dinamica e la funzione dei microtubuli sono modulate dalle interazioni con altre proteine, come MAP1, MAP2, Tau, Katanina e Kinesina 1,2,3,4,5.

Nei neuroni, i microtubuli sono essenziali per lo sviluppo e il ....

Protocollo

1. Dissezione delle larve

NOTA: La soluzione salina emolinfa-simile (HL3.1)¹⁸ e la soluzione fissante paraformaldeide al 4% (PFA)^19,20 vengono utilizzate a temperatura ambiente perché i microtubuli depolimerizzano quando la temperatura è troppo bassa.

1. Scegli una larva vagante di 3^° stadio con una lunga pinza smussata. Lavarlo con HL3.1 e posizionarlo sul piatto di dissezione sotto lo stereomicroscopio.
   NOTA: La larva errante di 3^° stadio è identificata dallo spiracolo anteriore ramificato e striscia intorno ....

Risultati

Abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per visualizzare la rete di microtubuli sia nelle giunzioni neuromuscolari (NMJ) che nelle cellule muscolari. Dopo la dissezione secondo il diagramma schematico (Figura 1A-E), viene eseguita l'immunocolorazione e le immagini vengono successivamente osservate e raccolte con un microscopio confocale laser o un microscopio stereoscopico a fluorescenza (Figura 1F,G).

Discussione

Qui viene descritto un protocollo per la dissezione e l'immunocolorazione delle giunzioni neuromuscolari larvali e delle cellule muscolari della Drosophila . Ci sono diversi punti essenziali da considerare. In primo luogo, evitare lesioni ai muscoli osservati è fondamentale durante il processo di dissezione. Potrebbe valere la pena fissare il filetto prima di rimuovere gli organi interni per evitare il contatto diretto tra le pinze e i muscoli. Per evitare danni muscolari o la separazione dall'epidermide larvale.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor Plus 405 falloidina	invitrogen	A30104	diluito 1:200
Medium di montaggio antisbiadimento avanzato	Beyotime	P0128M
FV10-ASW microscopio confocale	Olympus
Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 coniugato	Thermo Fisher	A-11001	diluito 1:1.000
Microscopio confocale laser LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Anticorpo anti-Futsch per topi	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	22C10	diluito 1:50
Anticorpo di topo anti-alfa;-tubulina	Sigma	T5168	diluito 1:1.000
Paraformaldeide	Wako	168-20955	Concentrazione finale: 4% in PB Buffer
Perni per minuzie in acciaio inossidabile	Entomoravia		Stereomicroscopio da 0,1 mm di diametro
SMZ161	Fluorescenza
microscopio BX41	Olympus
Texas Capra coniugata rossa anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		diluito 1:100
TO-PRO(R) 3 ioduro	Invitrogen	T3605	diluito 1:1.000
Agitatore decolorante a trasferimento TS-8	Strumenti da laboratorio Kylin-Bell	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Pinzette	Dumont	500342

stereoscopica Motic