Modellering af multipel sklerose hos de to køn: MOG35-55-induceret eksperimentel autoimmun encephalomyelitis
Summary
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis er en af de mest anvendte murinmodeller af multipel sklerose. I den nuværende protokol immuniseres C57BL/6J-mus af begge køn med myelinoligodendrocytglycoproteinpeptid, hvilket hovedsageligt resulterer i stigende parese af halen og lemmerne. Her diskuterer vi protokollen for EAE-induktion og evaluering.
Abstract
Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun inflammatorisk sygdom, der påvirker centralnervesystemet (CNS). Det er kendetegnet ved forskellig forekomst i kønnene, der påvirker flere kvinder end mænd, og forskellige resultater, der viser mere aggressive former hos mænd end hos kvinder. Desuden er MS meget heterogen med hensyn til kliniske aspekter, radiologiske og patologiske træk. Det er således nødvendigt at udnytte eksperimentelle dyremodeller, der tillader undersøgelse af så mange aspekter af patologien som muligt. Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) repræsenterer en af de mest anvendte modeller af MS hos mus, modellering af forskellige sygdomsfunktioner, fra aktivering af immunsystemet til CNS-skade. Her beskriver vi en protokol til induktion af EAE i både mandlige og kvindelige C57BL / 6J-mus ved hjælp af myelinoligodendrocytglycoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) immunisering, hvilket fører til udvikling af en kronisk form af sygdommen. Vi rapporterer også evalueringen af den daglige kliniske score og motoriske ydeevne hos disse mus i 28 dage efter immunisering (28 dpi). Endelig illustrerer vi nogle grundlæggende histologiske analyser på CNS-niveau med fokus på rygmarven som det primære sted for sygdomsinduceret skade.
Introduction
Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun inflammatorisk sygdom, der påvirker centralnervesystemet (CNS). Det viser tilstedeværelsen af perivaskulær infiltration af inflammatoriske celler, demyelinisering, aksonalt tab og gliose1. Dens ætiologi forbliver ukendt, og dens kliniske aspekter, radiografiske og patologiske træk tyder på bemærkelsesværdig heterogenitet i sygdommen2.
På grund af sin ukendte ætiologi og kompleksitet er der på nuværende tidspunkt ingen dyremodel, der sammenfatter alle de kliniske og radiologiske træk, der vises i human MS 3,4. Imidlertid anvendes forskellige dyremodeller til at studere forskellige aspekter af MS 3,4. I disse modeller er sygdomsinitiering typisk ekstremt kunstig, og tidsrammen for udbrud af kliniske tegn er forskellig mellem mennesker og mus. For eksempel hos mennesker er de patofysiologiske processer, der ligger til grund for sygdommen, uopdaget i årevis før begyndelsen af kliniske manifestationer. Omvendt kan eksperimenterne opdage symptomer i dyremodeller inden for uger eller endda dage efter MS-induktion4.
Tre grundlæggende dyremodeller producerer de træk ved demyelinisering, der er karakteristiske for MS: dem, der er virusinduceret (f.eks. Theilers murin encephalomyelitis-virus), dem, der induceres af toksiske stoffer (f.eks. Cuprizone, lysolecithin) og de forskellige varianter af eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE)5. Hver model hjælper med at studere nogle specifikke facetter af sygdommen, men ingen replikerer alle funktionerne i MS6. Det er derfor afgørende at vælge den rigtige model under hensyntagen til de specifikke eksperimentelle behov og de videnskabelige spørgsmål, der skal behandles.
Takket være immuniseringsprocedurer mod myelinafledte antigener induceres EAE ved at udløse et autoimmun respons på CNS-komponenter hos modtagelige mus. Samspillet mellem en lang række immunpatologiske og neuropatologiske mekanismer forårsager udvikling af de vigtigste patologiske træk ved MS (dvs. inflammation, demyelinisering, aksonalt tab og gliosis) hos de immuniserede mus 7,8. Mus begynder at vise kliniske symptomer omkring den anden uge efter immunisering og viser generelt stigende lammelse fra halen til lemmen og forbenet. Den kliniske score (dvs. kvantificering af akkumuleringen af sygdomsrelaterede underskud) vurderes generelt ved hjælp af en 5-punkts skala7.
Aktiv immunisering med protein eller peptid eller passiv overførsel af encephalitogene T-celler kan anvendes til at inducere EAE hos mus med forskellige genetiske baggrunde (fx SJL / J, C57BL / 6 og ikke-overvægtige diabetiske (NOD) mus). Myelinproteolipidprotein (PLP), myelinbasisk protein (MBP) og myelinoligodendrocytglycoprotein (MOG) er eksempler på selv-CNS-proteiner, hvorfra immunogener normalt produceres. Især udvikler SJL / J-mus, der er immuniseret med den immunodominerende epitop af PLP (PLP139-151), et recidiverende-remitterende (RR) sygdomsforløb, mens C57BL / 6J-mus immuniseret med det immunodominant MOG35-55-peptid viser EAE af kroniskkarakter 1. På trods af nogle begrænsninger, såsom at give meget lidt information om MS-progression, B-cellernes rolle i sygdommen, indefra-ud-mekanismerne eller vanskeligheder med at studere remyelinisering, har EAE-modellerne bidraget enormt til forståelsen af autoimmune og neuroinflammatoriske processer, øget viden inden for MS-området og dermed muliggjort udviklingen af nye terapeutiske tilgange til denne sygdom4, 6.
I dette arbejde fokuserede vi på en bestemt form for aktiv EAE, myelinoligodendrocytglycoproteinpeptidet 35-55 (MOG35-55)-induceret form 9,10,11,12. MOG35-55-induceret EAE modellerer en kronisk form for MS. Efter immunisering gennemgår musene en asymptomatisk fase inden for den første uge efter immunisering, derefter opstår sygdommen typisk i den anden uge efter immunisering, mens sygdommen mellem den tredje og fjerde uge efter immunisering bliver kronisk uden mulighed for fuld genopretning fra de akkumulerede underskud 7,8,13. Interessant nok observeres ingen forskelle mellem mænd og kvinder i forekomst, sygdomsdebut, forløb eller progression i de fleste af de undersøgelser, der findes i litteraturen14, selvom færre undersøgelser sammenligner sygdommen hos mænd og kvinder.
I modsætning hertil er disse parametre hos mennesker kendt for at være stærkt seksuelt dimorfe2. MS påvirker flere kvinder end mænd; Imidlertid udvikler mænd generelt en mere aggressiv form for sygdommen2. Disse beviser har antydet en væsentlig såvel som kompleks rolle af gonadale hormoner15; Ikke desto mindre forbliver kønshormonernes rolle og virkningsmekanisme i patologien uklar. Desuden understøtter data fra dyremodeller ideen om, at både østrogener og androgener udøver positive virkninger på forskellige kanaler i patologien på en kønsspecifik måde16,17.
Nogle undersøgelser tyder også på neurobeskyttende, promyeliniserende og antiinflammatoriske virkninger af progesteron18 , og selvom beviser hos MS-patienter er knappe18, kan neuroaktive steroider (dvs. de novo syntetiserede steroider i nervesystemet, såsom pregnenolon, tetrahydroprogesteron og dihydroprogesteron) også påvirke det patologiske forløb19. Samlet set understøtter disse data ideen om, at kønshormoner, der produceres både perifert og inde i CNS, har en vigtig og kønsspecifik rolle i sygdomsdebut og progression. Derfor opfordrer vi i dette arbejde til indsamling af separate data fra både han- og hundyr.
Fra det histopatologiske synspunkt tjener rygmarvets hvide stof som det vigtigste sted for CNS-skade i denne model, som er karakteriseret ved multifokale, sammenflydende regioner af mononukleær inflammatorisk infiltration og demyelinering8. Når vi beskriver denne protokol til induktion af MOG35-55-induceret EAE i C57BL/6J-mus, vil vi således tage hensyn til sygdomsresultatet hos de to køn og give nogle histopatologiske indsigter vedrørende rygmarven.
Protocol
Representative Results
Discussion
MOG35-55-induceret EAE-protokol, som vi beskrev, førte til udviklingen af en kronisk form for MS i C57BL/6J-mus 7,8,13. I disse repræsentative resultater rapporterede vi, at dyrene af begge køn, der gennemgik immuniseringsproceduren, udviklede en kronisk form af sygdommen (dvs. de genopretter ikke fuldt ud efter sygdommens begyndelse, de akkumulerer underskud og opretholder en CS mindst 1,5 i den kroniske fase).</p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet støttet af Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR-projektet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 og 2023-2027 til Institut for Neurovidenskab Rita Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Italien. BB var stipendiat i INFRA-P, Piemonte-regionen (n.378-35) (2022-2023) og PRIN 2020 – 20203AMKTW. Vi takker Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) for støtten. Udgivelsesgebyrerne er blevet støttet af den venlige donation af Distretto Rotaract 2031, og især Rotaract Club Torino Nord-Est. Vi takker Elaine Miller for korrekturlæsningen af vores manuskript.
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
Riferimenti
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
- Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
- Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
- Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
- Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
- Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
- McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
- Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
- Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
- Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
- Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
- Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
- Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
- vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
- Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
- Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
- Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
- Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
- Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
- Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
- Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
- Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
- Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
- Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
- Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).
