両性における多発性硬化症のモデル化:MOG35-55誘発性実験的自己免疫性脳脊髄炎
Summary
実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症の最も広く使用されているマウスモデルの1つです。現在のプロトコルでは、雌雄のC57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドを免疫し、主に尾と四肢の上行麻痺を引き起こします。ここでは、EAEの誘導と評価のプロトコルについて説明します。
Abstract
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。これは、性別で有病率が異なり、男性よりも女性に多く影響し、結果が異なり、女性よりも男性でより攻撃的な形態を示すことを特徴としています。さらに、MSは、臨床的側面、放射線学的、および病理学的特徴の点で非常に異質です。したがって、病理学のできるだけ多くの側面の調査を可能にする実験動物モデルを利用する必要があります。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、マウスで最もよく使用されるMSモデルの1つであり、免疫系の活性化から中枢神経系の損傷まで、さまざまな疾患の特徴をモデル化しています。ここでは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)免疫を使用して、雌雄のC57BL / 6JマウスにEAEを誘導するためのプロトコルについて説明します。また、これらのマウスの免疫後28日間(28dpi)の毎日の臨床スコアと運動能力の評価についても報告します。最後に、中枢神経系レベルでの基本的な組織学的解析を、疾患誘発性損傷の原発部位としての脊髄に焦点をあてて説明する。
Introduction
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)に影響を与える慢性自己免疫性炎症性疾患です。炎症細胞の血管周囲浸潤、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシスの存在を示します1。その病因は不明のままであり、その臨床的側面、X線写真、および病理学的特徴は、この疾患の顕著な異質性を示唆しています2。
その病因と複雑さが不明なため、現在のところ、ヒトMS3,4に示されたすべての臨床的および放射線学的特徴を再現する動物モデルはありません。しかし、MS 3,4のさまざまな側面を研究するために、さまざまな動物モデルが採用されています。これらのモデルでは、疾患の開始は通常、非常に人工的であり、臨床徴候の発症の時間枠はヒトとマウスで異なります。例えば、ヒトでは、疾患の根底にある病態生理学的過程は、臨床症状の発症前に何年も検出されない。逆に、実験者は、MS導入後数週間または数日以内に動物モデルの症状を検出することができます4。
MSに特徴的な脱髄の特徴は、ウイルス誘発性モデル(例:Theilerマウス脳脊髄炎ウイルス)、毒性物質(例:クプリゾン、リゾレシチン)によって誘発されるモデル、および実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のさまざまな変異体である5。各モデルは、この疾患のいくつかの特定の側面を研究するのに役立ちますが、MS6のすべての機能を再現するものはありません。したがって、特定の実験ニーズと対処すべき科学的問題を考慮して、正しいモデルを選択することが重要です。
ミエリン由来抗原に対する免疫処置により、EAEは感受性マウスのCNS成分に対する自己免疫応答を誘発することによって誘導されます。広範囲の免疫病理学的および神経病理学的メカニズムの相互作用は、免疫マウスにおけるMSの主要な病理学的形質(すなわち、炎症、脱髄、軸索喪失、およびグリオーシス)の発症を引き起こします7,8。マウスは接種後2週目頃から臨床症状を示し始め、一般的に尾から四肢、前肢にかけて上行麻痺を示します。臨床スコア(すなわち、疾患関連欠損の蓄積の定量化)は、一般に5段階評価7を用いて評価される。
タンパク質またはペプチドによる能動的免疫、または脳原性T細胞の受動的導入を使用して、異なる遺伝的背景を持つマウス(例、SJL/J、C57BL/6、および非肥満糖尿病(NOD)マウス)にEAEを誘導できます。ミエリンプロテオ脂質タンパク質(PLP)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)は、免疫原が通常産生される自己CNSタンパク質の例です。特に、PLPの免疫優性エピトープ(PLP139−151)で免疫されたSJL/Jマウスは再発寛解(RR)疾患の経過をたどり、免疫優性MOG35-55 ペプチドで免疫されたC57BL/6Jマウスは慢性的なEAEを示す1。多発性硬化症の進行、疾患におけるB細胞の役割、インサイドアウトのメカニズム、再髄鞘形成の研究の難しさなど、いくつかの制限があるにもかかわらず、EAEモデルは自己免疫および神経炎症プロセスの理解に大きく貢献し、MS分野の知識を増やし、この疾患の新しい治療法の開発を可能にしました4。6.
本研究では、活性EAEの特定の形態であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55(MOG35-55)誘導型9,10,11,12に着目しました。MOG35-55誘発EAEは、慢性型のMSをモデル化します。予防接種後、マウスは予防接種後1週間以内に無症候性期を経験し、その後、通常、予防接種後2週間目に発症し、予防接種後3週間から4週間の間に、病気は慢性化し、累積された赤字から完全に回復する可能性はありません7,8,13.興味深いことに、男性と女性の疾患を比較した研究が少ないとしても、文献14に存在するほとんどの研究で、発生率、疾患の発症、経過、または進行に男性と女性の間に差は観察されていません。
対照的に、ヒトでは、これらのパラメータは強く性的二形であることが知られています2。多発性硬化症は男性よりも女性に多く罹患します。しかし、男性は一般的により攻撃的な形態の病気を発症します2。この証拠は、生殖腺ホルモンの本質的かつ複雑な役割を示唆しています15。それにもかかわらず、病理学における性ホルモンの役割と作用機序は不明のままです。さらに、動物モデルからのデータは、エストロゲンとアンドロゲンの両方が性特異的な方法で病理学のさまざまな管にプラスの効果を及ぼすという考えを支持しています16,17。
いくつかの研究はまた、プロゲステロンの神経保護作用、前髄形成作用、および抗炎症作用を示唆しており18 、MS患者における証拠は乏しいが18、神経活性ステロイド(すなわち、プレグネノロン、テトラヒドロプロゲステロン、ジヒドロプロゲステロンなどの神経系による de novo 合成ステロイド)も病理学的経過に影響を与える可能性がある19.まとめると、これらのデータは、末梢と中枢神経系の両方で産生される性ホルモンが、疾患の発症と進行に重要かつ性特異的な役割を果たしているという考えを支持しています。したがって、本研究では、雄と雌の両方の動物から別々のデータを収集することを強く求めます。
組織病理学的観点から、脊髄の白質は、単核炎症性浸潤および脱髄の多発性、合流領域を特徴とするこのモデルにおけるCNS損傷の主要な部位として機能する8。したがって、C57BL / 6JマウスにおけるMOG35-55誘発性EAEの誘導のためのこのプロトコルを説明する際に、私たちは2つの性別の疾患転帰を考慮に入れ、脊髄に関するいくつかの組織病理学的洞察を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々が記述したMOG35-55誘導EAEプロトコルは、C57BL/6Jマウス7,8,13において慢性型MSの発症につながりました。これらの代表的な結果では、免疫処置を受けた雌雄ともに慢性疾患を発症した(発症後に完全に回復せず、欠損を蓄積し、慢性期でCS1.5以上を維持する)ことを報告した。
多くの研究が、こ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 and 2023-2027 to Department of Neuroscience Rita Levi Montalciniの支援を受けています。Cavalieri-Ottolenghi財団、オルバッサーノ、イタリア。BBは、INFRA-P、ピエモンテ地域(n.378-35)(2022-2023)およびPRIN 2020-20203AMKTWのフェローでした。Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus(FORB)の支援に感謝します。掲載料は、2031年ローターアクト地区、特にトリノ北東ローターアクトクラブからの寄付によって支えられています。原稿の校正をしてくれたElaine Millerに感謝します。
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
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