L'encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell'EAE.
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Articolo metodologico
Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG35-55
In questo articolo
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Sommario
Abstract
La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). È caratterizzata da una diversa prevalenza nei sessi, che colpisce più donne che uomini, e da esiti diversi, mostrando forme più aggressive negli uomini che nelle donne. Inoltre, la SM è altamente eterogenea in termini di aspetti clinici, caratteristiche radiologiche e patologiche. Pertanto, è necessario sfruttare modelli animali sperimentali che consentano di indagare il maggior numero possibile di aspetti della patologia. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) rappresenta uno dei modelli più utilizzati di SM nei topi, modellando diverse caratteristiche della malattia, dall'attivazione del sistema immunitario al danno al SNC. Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di EAE in topi C57BL/6J sia maschi che femmine utilizzando l'immunizzazione con il peptide glicoproteico 35-55 (MOG35-55) degli oligodendrociti mielinici, che porta allo sviluppo di una forma cronica della malattia. Riportiamo anche la valutazione del punteggio clinico giornaliero e delle prestazioni motorie di questi topi per 28 giorni dopo l'immunizzazione (28 dpi). Infine, illustriamo alcune analisi istologiche di base a livello del SNC, concentrandoci sul midollo spinale come sede primaria del danno indotto dalla malattia.
Introduzione
La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Mostra la presenza di infiltrazione perivascolare di cellule infiammatorie, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi1. La sua eziologia rimane sconosciuta e i suoi aspetti clinici, radiografici e patologici suggeriscono una notevole eterogeneità nella malattia2.
A causa della sua eziologia e complessità sconosciute, al momento, nessun modello animale ricapitola tutte le caratteristiche cliniche e radiologiche mostrate nella SMumana 3,4....
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Protocollo
La cura e la movimentazione degli animali nel presente lavoro è stata eseguita secondo la Direttiva del Consiglio dell'Unione Europea del 22settembre 2010 (2010/63/UE); tutte le procedure riportate nel presente studio sono state approvate dal Ministero della Salute (407/2018-PR) e dal Comitato Etico dell'Università di Torino (Progetto n° 360384). Suggeriamo di conformarsi al disegno sperimentale alle linee guida ARRIVE originariamente pubblicate da Kilkenny et al. nel 201020. Prima di iniziare, assicurarsi che siano disponibili i materiali necessari (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare in autoclave tutta la vet....
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Risultati
Follow-up dell'EAE dopo l'immunizzazione
Questo è stato valutato come descritto di seguito.
Peso corporeo e assunzione di cibo
L'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una diminuzione del peso corporeo degli animali EAE di entrambi i sessi, soprattutto entro la seconda settimana dopo l'induzione (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). T.......
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Discussione
Il protocollo EAE indotto da MOG35-55 che abbiamo descritto ha portato allo sviluppo di una forma cronica di SM nei topi C57BL/6J 7,8,13. In questi risultati rappresentativi, abbiamo riportato che gli animali di entrambi i sessi che sono stati sottoposti alla procedura di immunizzazione hanno sviluppato una forma cronica della malattia (cioè, non si riprendono completamente dopo l'insorgenza della malattia, accumulano.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare in relazione alla ricerca, alla paternità e/o alla pubblicazione di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 e 2023-2027 al Dipartimento di Neuroscienze Rita Levi Montalcini; Fondazione Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Italia. BB è stato borsista di INFRA-P, Regione Piemonte (n.378-35) (2022-2023) e PRIN 2020 - 20203AMKTW. Si ringrazia la Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) per il sostegno. Le spese di pubblicazione sono state sostenute dalla gentile donazione del Distretto Rotaract 2031, e in particolare del Rotaract Club Torino Nord-Est. Ringraziamo Elaine Miller per la correzione di bozze del nostro manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 18 G x 1 ½ “ Ago da 1,2 x 40 mm per la siringa di vetro | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Fotocamera digitale collegata al microscopio ottico | digitale NIKON DS-U1 | ||
| Bilancia elettronica di precisione | Merck | Mod. Kern-440-47N, risoluzione 0,1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Pipetta per siringa in vetro " ultra asept" 10 ml | di Sacco System | ||
| Vetreria (cioè becker per preparare l'emulsione) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Ematossilina (Mayer' s) | Filtro Sigma-Aldrich | MHS32 | prima di utilizzarlo. |
| Software di analisi delle immagini | Fiji | ||
| Incomplete Freund' s adiuvante (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Negozio a +4 °C. |
| Isoflurano | Wellona Pharma | Questo farmaco è usato come anestetico per inalazione. | |
| Topi maschi e femmine C57BL/6J | Jackson Laboratory, Envigo | Età 8-10 settimane, peso corporeo ottimale di ~20 g. | |
| Microtomo | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mezzo di montaggio | Merck | 107961 | |
| Topo Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), ceppo H37Ra | Laboratori Difco Inc. | 231141 | Negozio a +4 °C. |
| Peptide della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Conservare a -80 ° C diluito (2 mg/mL) in soluzione fisiologica; Preparalo il giorno dell'immunizzazione per evitare, per quanto possibile, alterazioni o contaminazioni. |
| Microscopio ottico | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Negozio a +4 gradi; C una volta diluito (4%) in tampone fosfato. |
| Tossina della pertosse (PT) | Duotech | PT.181 | Conservare a -80° C diluito (concentrazione 5 µ g/mL) in soluzione fisiologica |
| Soluzione fisiologica (soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%) | B. Eurospital | A 032182038 | Conservare a +4 ° C una volta aperto. |
| tampone fosfato salino (PBS) | Thermo Scientific | J61196. | |
| Software AP per l'acquisizione delle immagini | Siringhe NIS-Element AR 2.10 | ||
| U-100 0.5 mL con 30 G x 5/16" (0,30 x 8 mm) in ago fisso | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Siringhe U-100 1 mL con 26G x ½ ” (0,45 x 12,7 mm) in ago | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Unguento veterinario per gli occhi | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | Questa miscela di farmaco è usata come anestetico iniettabile e sedativo. | |
| Zolazepam e Tiletamina | Zoletil 100 | Questo farmaco è usato come anestetico iniettabile, sedativo, rilassante muscolare e analgesico |
Riferimenti
- Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
- Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.
