Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

טיפול בדיקור סיני במודל עכברי של תפקוד קוגניטיבי לקוי כרוני כתוצאה מהיפוקסיה

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65784
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5,6, 3,5, 4,7, 2,3, 8, 5,6
1Heilongjiang University of Chinese Medicine, 2Hebei Provincial Key Laboratory of Luobing, 3Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Disease), 4Hebei University of Chinese Medicine, 5Shijiazhuang Compound Traditional Chinese Medicine Technology Innovation Center, 6National Key Laboratory of Luobing Research and Innovative Chinese Medicine, 7Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd, 8The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום טיפול בהרדמה קלה ודיקור סיני על מודל עכבר היפוקסיה כרונית וביצוע בדיקות התנהגותיות כדי להעריך את השינויים הקוגנטיבים לאחר הטיפול.

Abstract

הטיפול בהפרעות עצבים מרכזיות מציב באופן עקבי אתגרים משמעותיים בפני התחום הרפואי. דיקור סיני, פרקטיקה לא תרופתית ששורשיה ברפואה הסינית המסורתית, כרוך בהחדרת מחטים עדינות לנקודות מדויקות בגוף ומשמש בדרך כלל לניהול מצבים מגוונים. לאחרונה, דיקור סיני התגלה כהתערבות טיפולית מבטיחה למגוון מחלות נוירולוגיות, כולל חרדה והפרעות נשימה. עם זאת, הפוטנציאל של דיקור סיני בטיפול בתפקוד קוגניטיבי לקוי הנגרם על ידי היפוקסיה כרונית עדיין לא נחקר. מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף לביסוס מודל עכברי של ליקוי קוגניטיבי כרוני הנגרם כתוצאה מהיפוקסיה, מתן הרדמה קלה, ביצוע טיפול בדיקור סיני והערכת שינויים התנהגותיים ויכולות זיכרון באמצעות מבחני שדה פתוח ומבוכי מים. פרוטוקול שלב אחר שלב מספק הוראות מפורטות על איתור ומיקום מדויק של נקודות דיקור ומחטים לשיפור קוגניטיבי. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, חוקרים יכולים לערוך מחקרים שיטתיים כדי להעריך ביסודיות את הפוטנציאל הטיפולי של דיקור סיני לבעיות קוגניטיביות.

Introduction

אוכלוסיית העולם מתמודדת כיום עם בעיית הזדקנות קריטית, וכתוצאה מכך עלייה מהירה בשכיחות של הפרעות קוגניטיביות. השכיחות העולמית של ליקוי קוגניטיבי היא כ 53.97 לכל 1000 שנות אדם1. היפוקסיה מוחית כרונית הנגרמת על ידי תפקוד לקוי של כלי הדם או הפרעות במחזור הדם / הנשימה נותרה אחד מגורמי הסיכון העיקריים לדמנציה הקשורה לגיל2. מחקרים קודמים הוכיחו כי היפוקסיה מוחית יכולה להגביר את שקיעת β העמילואיד על ידי שינוי ביטוי BACE13. בנוסף, היפוקסיה נקשרה לחוסר ויסות של תאי גליה ולדלקת עצבית 4,5. למרות ההיקף ההולך וגדל של בעיה זו, תרופות מערביות יעילות למניעת ירידה קוגניטיבית כרונית הנגרמת על ידי היפוקסיה חסרות כיום. רפואה סינית מסורתית לא תרופתית, במיוחד דיקור סיני, משמשת מזה אלפי שנים לטיפול בהפרעות קוגניטיביות והראתה תוצאות מבטיחות בהקלה על מחלות נוירודגנרטיביות 6,7. נקודות הדיקור Baihui, Shenting ו- Zusanli הן נקודות יעילות לטיפול בתפקוד קוגניטיבילקוי 8,9. מחקרים קליניים הוכיחו כי טיפול בדיקור סיני משפר באופן משמעותי את ציוני ההערכה הקוגניטיבית של מונטריאול (MoCA) ובדיקת מצב מיני-מנטלי (MMSE) בחולים עם ליקוי קוגניטיבי וסקולרי ומשפר ביעילות תפקוד קוגניטיבילקוי 8. למרות שמחקרים הראו כי דיקור סיני יכול לשפר באופן משמעותי את יכולת הזיכרון של חולדות עם קשירת עורקים - מודל היפוקסיה מוחית חריפה10, מודל היפוקסיה מוחית חריפה, אין דיווח על ההשפעות של דיקור סיני בכל מודל מכרסם עם הפרעות קוגניטיביות כרוניות הנגרמות על ידי היפוקסיה. היעדר מחקר על המנגנון פגע במידה ניכרת ביישומו הקליני.

מחקרים קודמים הראו כי חשיפת חולדות לסביבה היפוקסית לתקופה של 8 שבועות יכולה להעלות באופן משמעותי את רמות העקה החמצונית והדלקת במוח, וכתוצאה מכך ירידה בתפקוד הזיכרון11. המחקר הנוכחי נועד לחקור את השפעת הדיקור על מודלים של מכרסמים על מנת לקדם את הבנתנו זו. ראוי לציין, עם זאת, כי הרדמה נדרשת בדרך כלל במהלך טיפול דיקור במכרסמים בשל הפוטנציאל לתסיסה במהלך גירוי חוזר. הרדמה ממושכת יכולה להשפיע באופן משמעותי על התפקוד הקוגניטיבי בעכברים, שכן רוב תרופות ההרדמה יכולות לדכא פעילות עצבית ולעכב עיבוד מידע, מה שמוביל לליקויים התנהגותיים12. מספר מחקרים הראו כי מתן 2.5% sevoflurane למשך 6 שעות יכול לפגוע באופן משמעותי בזיכרון מרחבי, יכולת למידה ותשומת לב בעכברים13. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שמינונים גבוהים של הרדמה עלולים לגרום למוות עצבי או נזק עצבי בעכברים14. לכן, חובה לזהות גישה מתאימה כדי למזער את כמות ההרדמה הכוללת בשימוש. במחקר זה אנו מציגים שיטת דיקור יעילה לטיפול בעכברים עם ליקוי קוגניטיבי, יחד עם מבחנים התנהגותיים להערכת יכולות הזיכרון שלהם. חשוב לציין, אנו מציגים טכניקת הרדמה מותאמת לפני הטיפול שיכולה להפחית ביעילות את המינון הכולל של הרדמה הניתנת במהלך הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים בבעלי חיים נערכו באישור הוועדה למחקר ואתיקה בבעלי חיים של מכון המחקר הרפואי חביי יילינג (מספר אישור: N2022148). עכברי C57BL/6J זכרים במשקל 18-22 גרם (ראו טבלת חומרים) שוכנו במרכז החדש להערכת תרופות במכון המחקר הרפואי חביי יילינג. הם קיבלו מזון רגיל ומים נקיים ונחשפו לאור מלאכותי במשך 12 שעות ביום. החדרים שמרו על טווח טמפרטורות מבוקר של 20-26 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 40%-70%.

1. ביסוס מודל עכבר היפוקסיה כרונית (איור 1)

  1. לפני תחילת הניסוי, הכינו כלובים של בעלי חיים בלחץ אטמוספרי רגיל וכלובים עם סביבה רציפה דלת חמצן. צור סביבה רציפה דלת חמצן על ידי שימוש במערכת בקרת גז אוטומטית כדי לשטוף את התא בתערובת של חמצן טהור וחנקן.
    הערה: מערכת זו מתוכנתת לשלוט במתג השסתום האלקטרומגנטי, ובכך להבטיח אספקה מדויקת של גז הן מבחינת זמן והן מבחינת ריכוז.
  2. חלקו עכברים באופן אקראי לשלוש קבוצות: קבוצת ביקורת (Con), קבוצת מודל (CH) וקבוצת אלקטרו-אקופונקטורה (EA + CH). יש להניח עכברי בקרה ודגם/אלקטרו-דיקור בנפרד בשני הכלובים, עם 10 עכברים בכל כלוב. שמור על מחזור האור של 12 שעות/12 שעות (בהיר/כהה).
    הערה: לא נגרם טיפול או היפוקסיה בקבוצת הביקורת (Con). קבוצת המודל (CH) מורכבת מעכברים עם היפוקסיה כרונית. קבוצת הדיקור האלקטרו-אקופונקטורי (EA + CH) כוללת עכברים הנגרמים מהיפוקסיה וטופלו בדיקור חשמלי.
  3. לפיתוח היפוקסיה כרונית, לקבוע את הפרמטרים של תא חמצן נמוך על ידי שימוש במד חמצן דיגיטלי כדי לווסת את קצב זרימת הגז ולשמור על ריכוז חמצן של 10%. הניחו את בעלי החיים בתוך תא דל חמצן בשעה 9:00 בבוקר והוציאו אותם בשעה 17:00, וכתוצאה מכך סך של 8 שעות של חשיפה רצופה לחמצן נמוך ליום במשך 3 חודשים.
    הערה: בעת הגדרת אספקת גז חנקן כדי להפחית את ריכוז החמצן, מומלץ להמשיך לאט כדי למנוע הכנסה מוגזמת של גז חנקן בבת אחת, כפי שהוא יוביל למוות בעלי חיים.
  4. הערך את מודל התפקוד הקוגניטיבי הכרוני הנגרם על ידי היפוקסיה באמצעות בדיקה היסטולוגית ומבחנים התנהגותיים: מבחן שדה פתוח15 ומבחן מבוך מים16.

2. הרדמה (איור 2)

  1. הכינו את מכונת ההרדמה לבעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) ואת כרית החימום בטמפרטורה קבועה.
    הערה: במהלך הרדמה, בעלי חיים רגישים להיפותרמיה, מה שמדגיש את הצורך להשתמש בכרית חימום בטמפרטורה קבועה לבידוד.
  2. הכניסו את העכבר לקופסת השראת ההרדמה והכניסו במהירות איזופלורן של 2%-2.5% בחמצן (ראו טבלת חומרים) למשך כדקה.
    הערה: טיפול מקדים קצר טווח זה הוא צעד חיוני כדי להבטיח שעכברים יוכלו לשגשג תחת מינון בריכוז נמוך למשך פרק זמן ממושך.
  3. ברגע שהרגישות שלהם פחתה, צבטו את בוהן העכבר כדי לבדוק את הרפלקס שלו. לאחר מכן, העבר את העכבר אל כרית חימום הטמפרטורה קבועה (37 ° C).
  4. יש לכוונן את קצב זרימת ההרדמה לריכוז של כ-0.5%. חבר את מכונת ההרדמה לפה ולאף של העכבר. המשך בטיפול אלקטרו-אקופונקטורה תוך הבטחת תחזוקת ההרדמה.
    הערה: השפעת ההרדמה אושרה כאשר העכברים הפסיקו למצמץ. השפעת ההרדמה יכולה להימשך לפחות 30 דקות.

3. טיפול אלקטרו-אקופונקטורה

  1. כדי לשפר ביעילות תפקוד קוגניטיבי, בחרו נקודות דיקור ספציפיות, כגון Baihui (GV20), Shenting (GV24) ו-Zusanli דו-צדדי (ST36), בהתבסס על תיאוריית הרפואה הסינית המסורתית והניסיון הקליני (איור 3). יש לבצע טיפול בדיקור חשמלי שבועיים לפני השלמת תהליך הדוגמנות.
    1. אתר את נקודת הדיקור GV20 על קו האמצע של המצח, בנקודת האמצע של קו המחבר את קצות האוזניים7. עומק החדרת מחט הדיקור חייב להיות 2 מ"מ.
    2. אתר את נקודת הדיקור GV24 1.3 מ"מ ישירות מעל נקודת האמצע של עיני העכבר בקו האמצע של המצח17. עומק החדרת מחט הדיקור חייב להיות 2 מ"מ.
    3. אתר את נקודת הדיקור ST36 בצד החיצוני של מפרק הברך, כ -2 מ"מ מתחת לראש הפיבולה18,19. עומק החדרת מחט הדיקור חייב להיות 3-4 מ"מ.
  2. הכינו מחטי דיקור חד פעמיות (ראו טבלת חומרים) ומכשיר אלקטרו-אקופונקטורה (ראו טבלת חומרים) לצורך ההליך (איור 4).
  3. הניחו את העכבר במצב נוטה תחת הרדמה קלה עם 0.5% איזופלורן, וודאו שראשיהם וגפיהם משותקים. החזק מחט נירוסטה (קוטר: 0.18 מ"מ; אורך: 7 מ"מ) ביד ימין, באמצעות האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית.
  4. בצע דיקור סיני בנקודות דיקור GV20 ו- GV24 לרוחב לעומק 2 מ"מ, הרם את העור על ראש העכבר ביד שמאל. נקב את נקודת הדיקור ST36 אנכית לעומק 3-4 מ"מ על ידי נגיעה בראש הפיבולרי בצד הצדדי של מפרק הברך של העכבר ולחץ על העור עם האגודל השמאלי.
    הערה: עבור נקודות הדיקור הממוקמות על הראש, מומלץ להכניס את המחטים ברצף של GV24 ואחריו GV20. הזמנה זו מאפשרת נוחות תפעולית. נקודות דיקור הן מיקומים אנטומיים בדידים ולא נקודות נייחות. כתוצאה מכך, סטיות קלות בזווית החדרת המחט אינן משפיעות על היעילות הטיפולית, כפי שניתן לראות בחולים המקבלים טיפול אלקטרו-אקופונקטורה במסגרות קליניות.
  5. חברו את מכשיר הדיקור האלקטרוני למחטים, כאשר GV20 ו-ST36 השמאלי מחוברים למערכת אלקטרודות אחת ו-GV24 ו-ST36 הימני מחובר לאלקטרודה אחרת (איור 4). בחר את מצב הגל הרציף, עם עוצמת זרם חשמלי של 2 mA ותדר של 2 הרץ20,21. אשר את הטיפול האידיאלי על ידי התבוננות ברעד קל מקומי בנקודות דיקור וסובלנות שקטה על ידי העכבר.
    1. בעת חיבור מכשיר הדיקור החשמלי, חבר את הקצה הפרוקסימלי של המחט. זה עוזר למזער את ההשפעה הנגרמת על ידי משקל קו החיבור וכתוצאה מכך משפר את מניעת ניתוק המחט. במידת הצורך, השתמש בסרט הדבקה כדי לאבטח את המחט המוחדרת אופקית ואת קו החיבור.
  6. יש לנהל את הטיפול היומי במשך 30 דקות בכל יום במשך 6 ימים רצופים, עם יום מנוחה אחד בין כל מחזור טיפול.

4. בדיקת שדה פתוח (איור 5)

הערה: מבחן השדה הפתוח הוא שיטה קונבנציונלית המשמשת להערכת ההתנהגות האוטונומית, התנהגות חקרנית, יכולות קוגניטיביות והתנהגות חרדה של חיות ניסוי בסביבות חדשות ולא מוכרות22. הוא מורכב מתיבת תגובה בשדה פתוח ומכשיר הקלטה.

  1. כדי לבצע את הבדיקה, הכינו קובייה לבנה בגודל 50 ס"מ × 50 ס"מ × 30 ס"מ, כאשר התחתית מחולקת ל -25 ריבועים שווים בגודל 10 ס"מ × 10 ס"מ.
  2. הכנס את העכבר לתיבת התגובה בשדה הפתוח לצורך התאקלמות. אפשרו לעכבר לסייר בחדר הבדיקה ולהכיר את הסביבה החדשה במהלך תקופת ההתאקלמות. בצע את בדיקת השדה הפתוח לאחר התאקלמות העכבר לסביבת הניסוי למשך שעה אחת.
    הערה: זה מבטיח את מזעור החרדה או הלחץ הנגרמים על ידי שינויים בסביבה, ובכך מאפשר תוצאות מדויקות יותר במהלך ההערכות ההתנהגותיות הבאות.
  3. הנח את העכבר במרכז הקופסה ונטר אותו במשך 10 דקות לאחר שאיפשר לעכבר להסתגל לסביבה למשך 2 דקות.
    1. השתמשו במערכת מעקב וידאו (ראו טבלת חומרים) כדי לתעד את מסלול התנועה של העכבר, את המרחק הכולל שעבר, את זמן השהייה באזור המרכזי, את מהירות חציית האזור המרכזי ואת מספר הכניסות לאזור המרכזי במהלך הבחינה.
    2. בצע את הפעולות הרלוונטיות בהתאם להוראות במדריך המוצר של מערכת מעקב הווידאו. כל עכבר עובר בדיקה אחת ומתחיל לחקור מאותו מיקום בתוך הקופסה.
    3. לאחר כל בדיקה, נקו את קופסת השדה הפתוח עם 75% אתנול כדי למנוע תוצאות שגויות הנגרמות כתוצאה מהפרעות ריח בעת שימוש בעכבר.

5. מבוך מים (איור 5)

הערה: מבחן מבוך המים משמש לעתים קרובות ככלי הערכה התנהגותית בניסויים המערבים עכברים כדי להעריך את יכולות הלמידה והזיכרון המרחביות שלהם23.

  1. הכינו מיכל מים עגול בקוטר 120 ס"מ ובעומק 30 ס"מ. חלק את הטנק לארבעה רבעים שווים: I, II, III ו- IV. אם משתמשים בעכברים שחורים בניסוי, השתמשו במיכל מים לבנים; עבור עכברים לבנים, השתמש במיכל מים שחורים.
  2. הניחו וילונות סביב מיכל המים העגול כדי למנוע מהעכבר לראות את החוקרים במהלך הבדיקה.
  3. מקם סמנים שונים על המשטח העליון של מכל המים כרמזים חזותיים להתמצאות מרחבית. ודא שסמנים אלה נשארים נייחים לאורך כל הניסוי כדי לשמור על עקביות.
  4. מקמו משטח עגול בקוטר של 10 ס"מ ברביע III של מכל המים כאזור היעד המיועד. ודא שניתן להזיז ולאבטח את הפלטפורמה בקלות בכל מיקום רצוי.
  5. במהלך הניסוי, להכניס מים לתוך המיכל תוך שמירה על טווח טמפרטורות של 22-24 מעלות צלזיוס.
    1. ודא שמפלס המים נשאר באופן עקבי 1 ס"מ מעל פלטפורמת המטרה. כלול ריכוז של 20% של דו תחמוצת טיטניום לא רעיל במים כדי להשיג ניגוד ברור בין העכברים השחורים לבין הרקע הלבן. ניגודיות זו מאפשרת למצלמה להקליט את תנועות העכבר ואת הפרמטרים הרלוונטיים.
  6. בצע מבחן חקר מרחבי רציף בן 5 ימים על ידי מיקום רציף של כל עכבר ברבעים I, II, III ו- IV.
    1. מקם את העכבר עם הפנים לקיר. התרחק מהמבוך כדי למנוע מהעכבר להשתמש במיקום הנסיין כנקודת התייחסות. הקלט את הזמן שלוקח לעכבר למצוא את הפלטפורמה.
    2. אם העכבר לא מצליח לאתר את הפלטפורמה התת ימית תוך 90 שניות, הנחית את העכבר לפלטפורמה וספק תקופת למידה של 30 שניות. בנוסף, רשום את תקופת ההשהיה כ- 90 שניות.
    3. אם העכבר מאתר את הפלטפורמה התת-ימית תוך 90 שניות, הניחו לה להישאר על הרציף במשך 10 שניות ללמידה לפני הוצאותיה ממיכל המים.
    4. יבש את העכבר עם מגבת והחזיר אותו לכלוב שלו.
    5. סובב את המיקום של כל עכבר בכל רביע כל 20 דקות. תעד את מרחק השחייה, המהירות והזמן שלקח לכל עכבר למצוא את הפלטפורמה (תקופת ההשהיה) באמצעות מערכת מעקב הווידאו (ראה טבלת חומרים), ובצע את הפעולות הרלוונטיות בהתאם להוראות במדריך המוצר.
    6. הציבו את המשטח 1 ס"מ מעל פני המים ביום הראשון. הניחו את המצע בעומק של 1 ס"מ מתחת לפני המים בימים 2-5.
  7. ביום 6, הסירו את האסדה מרביע המטרה וערכו מבחן חקר מרחבי.
    1. מקם את העכבר ברביע I כדי לסייר בחופשיות במשך 90 שניות. המחשב רושם את מסלול השחייה של העכבר, את הזמן שבילה ברביע המטרה ואת מספר הפעמים שהוא חוצה את הרציף.
      הערה: על מנת למזער טעויות ניסוי הנגרמות על ידי גורמים אנושיים, חשוב לשמור על מיקום נקודת הייחוס קבוע בניסוי מבוך המים. בנוסף, הנסיין צריך לסגת מיד לאחר הנחת העכבר במים. לאחר השלמת הניסוי, יש לייבש את העכברים במגבת ולהחזיר אותם לכלובים שלהם כדי לשמור על חום.

6. צביעת המטוקסילין ואאוזין (איור 6)

הערה: בדיקה היסטולוגית של אזור ההיפוקמפוס מסייעת בהערכת הקמת מודל ההיפוקסיה ובקביעת יעילות הטיפול בדיקור.

  1. לאחר הניסוי ההתנהגותי, מרדימים את העכבר בזריקה תוך-צפקית של 20 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל ומחוררים אותו בתמיסת 10% פרפורמלדהיד (ראו טבלת חומרים) כדי להבטיח זילוח גוף מלא. בודדו את רקמת המוח וטבלו אותה בתמיסת 10% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 ימים כדי להשיג קיבוע.
  2. הניחו את דגימות המוח בקופסת הטבעה. לאחר מכן, לשטוף את דגימות המוח המעובד עם מים זורמים במשך 6 שעות.
  3. להעסיק מעבד רקמות אוטומטי כדי לייבש את הדגימות באמצעות סדרה של פתרונות אלכוהול עם ריכוזים הולכים וגדלים, כלומר, 60% אתנול במשך 1 שעות, 70% אתנול במשך 1 שעות, 90% אתנול במשך 1 שעות, 95% אתנול במשך 2 שעות, ולבסוף, 100% אתנול במשך 2 שעות.
  4. לטבול את דגימות הרקמה בקסילן במשך 2 שעות כדי להשיג שקיפות. לאחר מכן, לאחר השלמת תהליך ההתייבשות, להעביר את הדגימות permeabilized שעווה פרפין מחומם ל 60 ° C במשך 3 שעות. לבסוף, להטביע אותם במעבד אוטומטי.
  5. השתמש בכלי פריסה סיבובי כדי לקבל חתכים של 4 מיקרומטר. לאחר מכן, יש לצבוע את החלקים בהמטוקסילין למשך זמן שנע בין 3-8 דקות, ולאחר מכן להכתים את האאוזין למשך 1-3 דקות.
  6. מעבירים ברצף את החלקים המוכתמים למיכלים נפרדים של אלכוהול טהור וקסילן. לאחר מכן, אטמו ואבטחו את החלקים המוכתמים עם חניכיים ניטרליות כהכנה לבדיקה פתולוגית תחת מיקרוסקופ אופטי.
  7. השתמש בסורק שקופיות (ראה רשימת חומרים) כדי לסרוק את הפרוסות. לאחר מכן, השתמש בתוכנת הצפייה כדי לקבל את תוצאות צביעת HE עבור אזור ההיפוקמפוס. השווה את הסדר של נוירונים ואת עיבוי של גרעינים עצביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אפיון מסלולי תנועה של עכברים בניסוי השדה הפתוח
מפת המסלול מגלה כי עכברים בקבוצה הנורמלית מפגינים נטייה עמוקה לחקור בסביבות לא מוכרות. מסלולי הפעילות שלהם מרוכזים בעיקר בפינות תוך כיסוי כל השדה הפתוח (פאנל שמאלי). לעומת זאת, קבוצת מודל ההיפוקסיה ארוכת הטווח של עכברים מפגינה רצון מופחת באופן משמעותי לחקור סביבות חדשות. הם משתהים בעיקר בפינות מבלי להפגין התנהגות חקרנית כלשהי כלפי מרכז השדה הפתוח (לוח אמצעי). לאחר טיפול בדיקור סיני, הפעילות החקרנית של עכברים הנגרמים על ידי היפוקסיה מראה שיפור, וההתנהגות שלהם של יציאה לכיוון מרכז השדה הפתוח חוזרת (פאנל ימני) (איור 5A).

אפיון למידה מרחבית וזיכרון בעכברים
בקבוצה הרגילה, עכברים בילו זמן רב יחסית ברביע המטרה וחצו את הפלטפורמה בתדירות גבוהה יותר, כפי שמוצג במפת המסלול (פאנל שמאלי). קבוצת המודל ההיפוקסי ארוך הטווח של עכברים הדגימה יכולות זיכרון מרחבי מוחלשות בהשוואה לקבוצה הרגילה, כפי שמעיד חוסר יכולתם לאתר את רביע המטרה בזמן שצוין (לוח אמצעי). לאחר טיפול בדיקור סיני, העכברים הראו שיפור משמעותי ביכולות הזיכרון המרחבי שלהם כתוצאה מההיפוקסיה. הם הפגינו התנהגות גישושית מאורגנת יותר ובילו זמן רב יותר ברביע המטרה (פאנל ימני) (איור 5B).

בדיקה היסטולוגית של מוח העכבר
בקבוצת הביקורת, סידור תאי העצב באזור ההיפוקמפוס של עכברים (פאנל שמאלי עליון) הראה סדירות, בעוד שהוא שובש בקבוצת המודל ההיפוקסית ארוכת הטווח (פאנל ימני עליון). לעומת זאת, קבוצת הטיפול הראתה שיפור בסידור הנוירונים (פאנל תחתון). יתר על כן, קבוצת המודל הראתה התכווצות מוגברת של גרעינים עצביים בעכבר בהשוואה לקבוצת הביקורת, אך השפעה זו הוקלה חלקית בקבוצת הטיפול. (איור 6).

Figure 1
איור 1: ביסוס מודל עכברי לליקוי קוגניטיבי כתוצאה מהיפוקסיה. העכברים נחשפו להיפוקסיה מהיום הראשון עד היום ה-90. טיפול בדיקור חשמלי ניתן מדי יום מהיום ה-75, כאשר כל מחזור טיפול נמשך 6 ימים ובסך הכל 2 מחזורי טיפול. הייתה הפסקה של יום אחד בין מחזורים. המבחנים ההתנהגותיים נערכו ביום ה-93. בדיקה היסטולוגית ובדיקה התנהגותית ניתן לבצע ביום 65 כדי לאשר את הקמת המודל באזור ההיפוקמפוס. קיצורים: שני: חודש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: טיפול מקדים בהרדמה לפני אלקטרו-אקופונקטורה. לפני שעברו טיפול אלקטרו-אקופונקטורה, העכברים הורדמו באמצעות מכשיר הרדמה (A). לאחר מכן הוכנסו העכברים לקופסה (B) עם (C) 2% איזופלורן בתא. (ד) משך שיטת ההרדמה המתוקנת היה קצר יותר בהשוואה לשיטת ההרדמה הקלאסית. (E) עכברים הנתונים להרדמה קלה שומרים על תגובתם לגירוי כף הרגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מבנה אנטומי של נקודות דיקור על ראש העכבר. איור זה מתאר את המיקומים האנטומיים של GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) ו-ST36 (Zusanli) בעכברים. (A) מבט אנטומי על ראש העכבר המראה את העצמות המצחיות והקודקודיות. (B) מבט אנטומי על רגל העכבר המראה את השוקה, הפיבולה והראש הפיבולרי. (C) מיקומים של נקודות דיקור על ראש העכבר. (D) GV20 ממוקם על קו האמצע של המצח, בנקודת האמצע בין קצות האוזניים, וישירות על גבי עצם הקודקוד. GV24 ממוקם על קו האמצע של המצח, רק קדמי לצומת של העצמות הקדמיות והקודקודיות. ST36 ממוקם בצד החיצוני של הרגל האחורית, כ-2 מ"מ מתחת לראש הפיבולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: טיפול אלקטרו-אקופונקטורה. העכברים עברו גירוי מחטים בנקודות ספציפיות ב-GV20 (Baihui), GV24 (Shenting) ו-ST36 דו-צדדי (Zusanli) בזמן שהיו תחת הרדמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות של בדיקת השדה הפתוח ובדיקת מבוך המים לאחר טיפול בדיקור חשמלי. (A) בדיקת השדה הפתוח נערכה כדי להעריך את השינויים ההתנהגותיים בעכברים שהיו נתונים לטיפול בהיפוקסיה כרונית (CH) ובדיקור סיני (EA). מהניסוי נוצרו שלוש חלקות מסלול מייצגות. (B) בדיקת מבוך המים נערכה כדי להעריך את הזיכרון המרחבי של עכברים שעברו טיפול בהיפוקסיה כרונית ובדיקור סיני. מהניסוי נוצרו שלוש חלקות מסלול מייצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: בדיקה היסטולוגית של מוח עכבר לאחר טיפול אלקטרו-אקופונקטורה. תמונות היסטולוגיות של העכברים בקבוצת הביקורת (פאנל שמאלי עליון), קבוצת ההיפוקסיה (פאנל ימני עליון) וקבוצת הטיפול (פאנל תחתון). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אקופונקטורה, פרקטיקה רפואית לא פרמקולוגית שמקורה בסין לפני למעלה מ -2,000 שנה, כוללת החדרת מחטים דקות לנקודות ספציפיות בגוף הידועות כנקודות דיקור. מאמינים כי נקודות אלה מחוברות על ידי ערוצים או מרידיאנים שדרכם זורמת האנרגיה החיונית של הגוף, או "צ'י",24 . על ידי גירוי נקודות אלה, דיקור שואף להחזיר איזון והרמוניה לגוף. הוכח כי הוא מטפל ביעילות במצבים שונים, כולל כאבים כרוניים, חרדה/דיכאון, בעיות עיכול, כאבי מחזור והפרעות נשימה 25,26,27,28,29. בשנים האחרונות, דיקור סיני התגלה כהתערבות טיפולית יעילה למחלות עצביות, כולל תפקוד קוגניטיבי לקוי. מחקרים רבים הוכיחו את יכולתו לווסת מוליכים עצביים, להגביר את זרימת הדם במוח, להפחית עקה חמצונית ולשפר את הגמישות המוחית 20,30,31,32. כתוצאה מכך, הוא מוכר יותר ויותר כאפשרות טיפול בטוחה ויעילה, במיוחד כאשר משתמשים בו לצד טיפול רפואי קונבנציונלי33. עם זאת, למרות ההיסטוריה הארוכה שלה והשימוש הנרחב, מנגנון הפעולה של דיקור סיני נשאר מובן לחלוטין. תיאוריה אחת מציעה כי דיקור סיני מעודד שחרור אנדורפינים, משככי הכאבים הטבעיים של הגוף, ובכך מקל על הכאב ומקדם תחושת רווחה34. תיאוריה אחרת גורסת כי דיקור סיני עשוי להשפיע על מערכת העצבים האוטונומית, המסדירה תפקודי גוף לא רצוניים שונים35,36. למרות שהבנתנו את מנגנוני הדיקור עדיין מתפתחת, גוברת ההכרה בקרב מדענים כי מתודולוגיית מעבדה סטנדרטית לדיקור סיני, במיוחד באמצעות מודלים של מכרסמים, חיונית כדי להנחות את המחקר בתחום זה.

בחירת פרוטוקול הרדמה מתאים היא השלב המכריע הראשוני בביצוע דיקור סיני במודל עכברי. פרוטוקולים מסורתיים כוללים לעתים קרובות הרדמה מתמשכת במינון גבוה, אשר יכולה להיות בעלת השפעות משמעותיות על מערכת העצבים של העכבר ועלולה לגרום לתוצאות שליליות שגויות של בדיקות התנהגותיות לאחר טיפול בדיקור. במחקר זה, אנו מציעים פרוטוקול משופר המשתמש בקופסת הרדמה אטומה כדי להרדים את העכברים בגז עד שהם מאבדים את הכרתם. לאחר מכן, נשמר מצב יציב באמצעות הרדמה במינון נמוך במהלך הטיפול בדיקור. שיטה זו מסייעת למזער הפרעות תפקודיות והתנהגותיות הנגרמות על ידי מינון הרדמה מופרז ומשפרת את דיוק הניסויים. בנוסף, חוקרים יכולים לבחור באיזופלורן במקום קטמין וקסילזין מכיוון שהוא מציע זמן התאוששות מהיר יותר ומפחית את סיכוני הרעילות המערכתיים הקשורים לקטמין וקסילזין37. עם זאת, חשוב לציין כי תוצאות שליליות כוזבות הנגרמות על ידי הרדמה עדיין עלולות להתרחש. אפילו הרדמה קלה הנמשכת שבועיים רצופים יכולה להשפיע לרעה על הקוגניציה38. על מנת להעריך בצורה מדויקת יותר את יעילות הטיפול, החוקרים יכולים לשלב קבוצה נוספת של עכברים מורדמים שאינם מקבלים טיפול למטרות השוואה. היבט קריטי נוסף של טיפול בדיקור סיני בעכברים הוא קביעת השילוב של נקודות דיקור. נקודות דיקור נפוצות למחלות מערכת העצבים המרכזית בבני אדם כוללות Baihui (GV20), Yintang (EX-HN3), Shenting (GV24) ו- Zusanli (ST36)39,40,41. במחקר זה התמקדנו בהכללת Baihui (GV20), Shenting (GV24) ו-Zusanli (ST36) לטיפול. למרות האתגרים שמציב גודלם הקטן של עכברים בלוקליזציה של נקודות דיקור, מיקום משותף המבוסס על מבנים אנטומיים מוכיח את עצמו כשיטה יעילה. לבסוף, קביעת תדירות ועוצמת הגירוי המתאימים היא שלב מפתח נוסף בביצוע טיפול בדיקור סיני בעכברים. במחקר זה השתמשנו בדיקור חשמלי בתדר נמוך של 2 הרץ ובעוצמה בינונית של 2 מיליאמפר. למרות שהתוצאה הטיפולית של הדיקור ניכרת, נדרשת חקירה נוספת כדי להבין את המנגנון העומד בבסיסו.

למרות היישומים הפוטנציאליים הרחבים של דיקור סיני בטיפול בהפרעות נוירולוגיות, לטכניקה זו יש מגבלות מסוימות. מגבלה אחת היא התלות הגבוהה שלו בניסיון של המפעיל, שיכולה לגרום לתוצאות לא אופטימליות או לפגוע בנבדקים ניסיוניים כאשר היא מבוצעת על ידי מפעילים חסרי ניסיון. מגבלה נוספת היא הצורך בשיפור הטיפול בדיקור קליני כדי לשפר את יעילותו. כיום, חוקרים חוקרים את השילוב של דיקור סיני עם טיפולים אחרים, כגון התערבויות פרמקולוגיות ואימון קוגניטיבי, על מנת לשפר את תוצאות הטיפול42. בנוסף, ההתקדמות הטכנולוגית הובילה לפיתוח טכניקות חדשות, כמו גירוי מגנטי טרנס-גולגולתי (TMS), שניתן להשתמש בהן בשילוב עם דיקור סיני כדי לשפר עוד יותר את התפקוד הקוגניטיבי43. למרות מגבלות אלו, דיקור סיני הראה יתרונות משמעותיים בטיפול בהפרעות נוירולוגיות שונות וטומן בחובו פוטנציאל רב ליישומים עתידיים, במיוחד בשילוב עם טיפולים אחרים. מאמר זה מספק שיטות מפורטות לבניית מודל עכברי של ליקוי קוגניטיבי כרוני הנגרם כתוצאה מהיפוקסיה, תהליך הטיפול בדיקור סיני ושיטות בדיקה התנהגותיות. שיטות אלו יכולות לסייע לחוקרים לערוך מחקרים מעמיקים על היישום והמנגנון של הדיקור הסיני, ובכך לקדם את התקדמות הרפואה הסינית המסורתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית S&T של חביי (NO.E2020100001, ו- NO.22372502D), פרויקט כישרונות חדשנות ויזמות ברמה גבוהה של Shijiazhuang (מס '07202203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% paraformaldehyde solution Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd RL3234
ANY-maze Science  SA201 Video tracking system
C75BL/6J mice BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD No.110322220103041767 Gender: Male,  Weight: 18–22 g
Electroacupuncture device Great Wall KWD-808 I
Hwato acupuncture  needle Suzhou Medical Appliance Factory 2655519 
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22
NanoZoomer Digital Pathology Hamamatsu Photonics K. K C9600-01
Small animal anesthesia machine RWD YL-LE-A106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pais, R., Ruano, L., Carvalho, O. P., Barros, H. Global cognitive impairment prevalence and incidence in community dwelling older adults- A systemic review. Geriatrics. 5 (4), Basel, Switzerland. 84 (2020).
  2. Tian, Z., Ji, X., Liu, J. Neuroinflammation in vascular cognitive impairment and dementia: Current evidence, advances, and prospects. International Journal of Molecular Sciences. 23 (11), 6224 (2022).
  3. Yuan, Y., et al. Activation of ERK-Drp1 signaling promotes hypoxia-induced Aβ accumulation by upregulating mitochondrial fission and BACE1 activity. FEBS open bio. 11 (10), 2740-2755 (2021).
  4. Zhu, X., et al. NLRP3 deficiency protects against hypobaric hypoxia induced neuroinflammation and cognitive dysfunction. Ecotoxicology and Environmental Safety. 255, 114828 (2023).
  5. Li, B., Dasgupta, C., Huang, L., Meng, X., Zhang, L. MiRNA-210 induces microglial activation and regulates microglia-mediated neuroinflammation in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Cellular & Molecular Immunology. 17 (9), 976-991 (2020).
  6. Cai, M., Lee, J. H., Yang, E. J. Electro-acupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 264 (2019).
  7. Xie, L., et al. Electro-acupuncture improves M2 microglia polarization and glia anti-inflammation of hippocampus in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 689629 (2021).
  8. Huang, L., et al. Effects of acupuncture on vascular cognitive impairment with no dementia: A randomized controlled trial. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 81 (4), 1391-1401 (2021).
  9. Xi, L., Fang, F., Yuan, H., Wang, D. Transcutaneous electrical acupoint stimulation for postoperative cognitive dysfunction in geriatric patients with gastrointestinal tumor: a randomized controlled trial. Trials. 22 (1), 563 (2021).
  10. Du, S. Q., et al. Acupuncture inhibits TXNIP-associated oxidative stress and inflammation to attenuate cognitive impairment in vascular dementia rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24 (1), 39-46 (2018).
  11. Zhang, C. E., et al. Hypoxia-induced tau phosphorylation and memory deficit in rats. Neuro-Degenerative Diseases. 14 (3), 107-116 (2014).
  12. Liang, X., Zhang, R. Effects of minocycline on cognitive impairment, hippocampal inflammatory response, and hippocampal Alzheimer's related proteins in aged rats after propofol anesthesia. Disease Markers. 2022, 4709019 (2022).
  13. Lee, J. R., et al. Effect of dexmedetomidine on sevoflurane-induced neurodegeneration in neonatal rats. British Journal of Anaesthesia. 126 (5), 1009-1021 (2021).
  14. Matsumoto, Y., Fujino, Y., Furue, H. Anesthesia and surgery induce a functional decrease in excitatory synaptic transmission in prefrontal cortex neurons, and intraoperative administration of dexmedetomidine does not elicit the synaptic dysfunction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 572, 27-34 (2021).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods in Molecular Biology. 1916, Clifton, N.J. 99-103 (2019).
  16. Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2920 (2011).
  17. Lin, W., et al. TNEA therapy promotes the autophagic degradation of NLRP3 inflammasome in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease via TFEB/TFE3 activation. Journal of Neuroinflammation. 20 (1), 21 (2023).
  18. Liu, S., et al. A neuroanatomical basis for electro-acupuncture to drive the vagal-adrenal axis. Nature. 598 (7882), 641-645 (2021).
  19. Jang, J. H., et al. Acupuncture inhibits neuroinflammation and gut microbial dysbiosis in a mouse model of Parkinson's disease. Brain, Behavior, and Immunity. 89, 641-655 (2020).
  20. Dong, W., et al. Electro-acupuncture improves synaptic function in SAMP8 mice probably via inhibition of the AMPK/eEF2K/eEF2 signaling pathway. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2019, 8260815 (2019).
  21. Han, Y. G., et al. Electro-acupuncture prevents cognitive impairment induced by lipopolysaccharide via inhibition of oxidative stress and neuroinflammation. Neuroscience Letters. 683, 190-195 (2018).
  22. Zhang, Q., et al. Electro-acupuncture pre-treatment ameliorates anesthesia and surgery-induced cognitive dysfunction via inhibiting mitochondrial injury and neuroapoptosis in aged rats. Neurochemical Research. 47 (6), 1751-1764 (2022).
  23. Zheng, X., et al. Electro-acupuncture ameliorates beta-amyloid pathology and cognitive impairment in Alzheimer disease via a novel mechanism involving activation of TFEB (transcription factor EB). Autophagy. 17 (11), 3833-3847 (2021).
  24. Zhou, W., Benharash, P. Effects and mechanisms of acupuncture based on the principle of meridians. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 7 (4), 190-193 (2014).
  25. Sun, Y., et al. Efficacy of Acupuncture For Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome : A Randomized Trial. Annals of Internal Medicine. 174 (10), 1357-1366 (2021).
  26. Jung, J., et al. Lipidomics reveals that acupuncture modulates the lipid metabolism and inflammatory interaction in a mouse model of depression. Brain, Behavior, and Immunity. 94, 424-436 (2021).
  27. Yang, N. N., et al. Electro-acupuncture ameliorates intestinal inflammation by activating α7nAChR-mediated JAK2/STAT3 signaling pathway in postoperative ileus. Theranostics. 11 (9), 4078-4089 (2021).
  28. Shetty, G. B., Shetty, B., Mooventhan, A. Efficacy of acupuncture in the management of primary dysmenorrhea: A randomized controlled trial. Journal of Acupuncture and Meridian Studies. 11 (4), 153-158 (2018).
  29. Nurwati, I., Purwanto, B., Mudigdo, A., Saputra, K., Prasetyo, D. H., Muthmainah, M. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
  30. Li, P., et al. Acupuncture can play an antidepressant role by regulating the intestinal microbes and neurotransmitters in a rat model of depression. Medical Science Monitor. 27, 929027 (2021).
  31. Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
  32. Yang, J. W., Wang, X. R., Ma, S. M., Yang, N. N., Li, Q. Q., Liu, C. Z. Acupuncture attenuates cognitive impairment, oxidative stress and NF-κB activation in cerebral multi-infarct rats. Acupuncture in Medicine. 37 (5), 283-291 (2019).
  33. Li, X., et al. Traditional Chinese acupoint massage, acupuncture, and moxibustion for people with diabetic gastroparesis: A systematic review and meta-analysis. Medicine. 101 (48), 32058 (2022).
  34. Yang, X. Y., et al. Effect of combined acupuncture-medicine anesthesia in thyroid nodule ablation and its effect on serum β-endorphin. Acupuncture Research. 45 (12), 1006-1009 (2020).
  35. Uchida, C., et al. Effects of Acupuncture Sensations on Transient Heart Rate Reduction and Autonomic Nervous System Function During Acupuncture Stimulation. Medical Acupuncture. 31 (3), 176-184 (2019).
  36. Liang, C., Wang, K. Y., Gong, M. R., Li, Q., Yu, Z., Xu, B. Electro-acupuncture at ST37 and ST25 induce different effects on colonic motility via the enteric nervous system by affecting excitatory and inhibitory neurons. Neurogastroenterology and Motility. 30 (7), 13318 (2018).
  37. Michelson, N. J., Kozai, T. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  38. Yu, X., Zhang, F., Shi, J. Sevoflurane anesthesia impairs metabotropic glutamate receptor-dependent long-term depression and cognitive functions in senile mice. Geriatrics & Gerontology International. 19 (4), 357-362 (2019).
  39. Jeong, J. H., et al. Investigation of combined treatment of acupuncture and neurofeedback for improving cognitive function in mild neurocognitive disorder: A randomized, assessor-blind, pilot study. Medicine. 100 (37), 27218 (2021).
  40. Lin, Y. K., Liao, H. Y., Watson, K., Yeh, T. P., Chen, I. H. Acupressure improves cognition and quality of life among older adults with cognitive disorders in long-term care settings: A clustered randomized controlled trial. Journal of the American Medical Directors Association. 24 (4), 548-554 (2023).
  41. Wu, W. Z., et al. Effect of Tongdu Tiaoshen acupuncture on serum GABA and CORT levels in patients with chronic insomnia. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 41 (7), 721-724 (2021).
  42. Zhuo, P. Y., et al. Efficacy and safety of acupuncture combined with rehabilitation training for poststroke cognitive impairment: A systematic review and meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 32 (9), 107231 (2023).
  43. Li, R. Y., Huang, R. J., Yu, Q. Comparison of different physical therapies combined with acupuncture for poststroke cognitive impairment: A network meta-analysis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1101101 (2021).

Tags

התנהגות גיליון 202 היפוקסיה כרונית פגיעה קוגניטיבית הרדמה קלה רפואה סינית מסורתית לא תרופתית
טיפול בדיקור סיני במודל עכברי של תפקוד קוגניטיבי לקוי כרוני כתוצאה מהיפוקסיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., … More

Wan, F., Guo, Z., Wang, M., Hou, Y., Wang, L., Li, W., Kang, N., Zhu, P., Li, M. Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction. J. Vis. Exp. (202), e65784, doi:10.3791/65784 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter