संभावित लक्ष्य पहचान और दवा की खोज के लिए एक मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल का विकास और अनुकूलन
Summary
हम हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) ऑर्गेनॉइड गठन के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल का एक व्यापक अवलोकन और शोधन प्रदान करते हैं, जिसमें ऑर्गेनॉइड खेती के सभी चरण शामिल हैं। यह प्रणाली संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और दवा उम्मीदवार प्रभावशीलता के आकलन के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में कार्य करती है।
Abstract
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया भर में एक अत्यधिक प्रचलित और घातक ट्यूमर है और इसकी देर से खोज और प्रभावी विशिष्ट चिकित्सीय एजेंटों की कमी के कारण इसके रोगजनन और उपचार में और शोध की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनोइड्स, एक उपन्यास मॉडल जो देशी ट्यूमर ऊतक जैसा दिखता है और इन विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है, ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण रुचि प्राप्त की है, यकृत कैंसर के लिए ऑर्गेनोइड मॉडल के विकास पर कई रिपोर्टों के साथ। इस अध्ययन में, हमने प्रक्रिया को सफलतापूर्वक अनुकूलित किया है और एक संस्कृति प्रोटोकॉल स्थापित किया है जो स्थिर पासिंग और संस्कृति स्थितियों के साथ बड़े आकार के एचसीसी ऑर्गेनोइड के गठन को सक्षम बनाता है। हमने एचसीसी ऊतक पृथक्करण, ऑर्गेनॉइड चढ़ाना, संस्कृति, पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन की पूरी प्रक्रिया को कवर करते हुए प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को व्यापक रूप से रेखांकित किया है, और इस पत्र में विस्तृत सावधानी बरती है। ये ऑर्गेनोइड मूल एचसीसी ऊतकों के लिए आनुवंशिक समानता प्रदर्शित करते हैं और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जा सकते हैं, जिसमें ट्यूमर के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान और बाद में दवा विकास शामिल है।
Introduction
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी), एक प्रचलित और व्यापक रूप से विविध ट्यूमर1, ने चिकित्सा समुदाय के भीतर काफी ध्यान आकर्षित किया है। एचसीसी में वंश प्लास्टिसिटी और पर्याप्त विविधता की उपस्थिति से पता चलता है कि विभिन्न रोगियों से उत्पन्न ट्यूमर कोशिकाएं और यहां तक कि एक ही रोगी के भीतर अलग-अलग घाव असमान आणविक और फेनोटाइपिक लक्षण प्रकट कर सकते हैं, जिससे अभिनव चिकित्सीय दृष्टिकोण 2,3,4,5 की उन्नति में दुर्जेय बाधाएं पेश हो सकती हैं. नतीजतन, एचसीसी में जैविक विशेषताओं और दवा प्रतिरोध के तंत्र की बढ़ी हुई समझ की अनिवार्य आवश्यकता है ताकि अधिक प्रभावी उपचार रणनीतियों के निर्माण को सूचित किया जा सके।
हाल के दशकों में, शोधकर्ताओं ने एचसीसी 3,4 का अध्ययन करने के उद्देश्य से इन विट्रो मॉडल के विकास के लिए अपने प्रयासों को समर्पित किया है। कुछ प्रगति के बावजूद, सीमाएं बनी रहती हैं। इन मॉडलों में कई प्रकार की तकनीकें शामिल हैं, जैसे सेल लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं और रोगी-व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) का उपयोग। सेल लाइनें एचसीसी रोगियों से प्राप्त ट्यूमर कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में काम करती हैं, जो सुविधा और आसान विस्तार के लाभ प्रदान करती हैं। प्राथमिक सेल मॉडल में रोगी ट्यूमर के ऊतकों से प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं का प्रत्यक्ष अलगाव और संस्कृति शामिल होती है, जिससे जैविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व होता है जो स्वयं रोगियों के समान होते हैं। पीडीएक्स मॉडल चूहों में रोगी ट्यूमर के ऊतकों के प्रत्यारोपण को लागू करता है, जिसका उद्देश्य ट्यूमर के विकास और प्रतिक्रिया को अधिक ईमानदारी से अनुकरण करना है। ये मॉडल एचसीसी अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, फिर भी उनके पास कुछ सीमाएं हैं, जिनमें सेल लाइनों की विषमता और विवो स्थितियों में पूरी तरह से दोहराने में असमर्थता शामिल है। इसके अलावा, इन विट्रो की खेती में लंबे समय तक कोशिकाओं की मूल विशेषताओं और कार्यात्मकताओं में गिरावट हो सकती है, एचसीसी के जैविक गुणों का सटीक प्रतिनिधित्व करने में चुनौतियों का सामना करना पड़ सकता है। इसके अतिरिक्त, पीडीएक्स मॉडल का उपयोग समय लेने वाली और महंगादोनों है 3.
इन सीमाओं को संबोधित करने और एचसीसी की शारीरिक विशेषताओं को अधिक सटीक रूप से दोहराने के लिए, ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी के उपयोग को एक आशाजनक अनुसंधान मंच के रूप में पेश किया गया है जो पिछली बाधाओं को पार करने में सक्षम है। ऑर्गेनोइड्स, जो इन विट्रो में सुसंस्कृत त्रि-आयामी सेल मॉडल हैं, वास्तविक अंगों की संरचना और कार्यक्षमता को दोहराने की क्षमता रखते हैं। हालांकि, एचसीसी के संदर्भ में, ऑर्गेनॉइड मॉडल स्थापित करने में कुछ चुनौतियां मौजूद हैं। इन चुनौतियों एचसीसी organoid निर्माण प्रक्रियाओं के अपर्याप्त विस्तृत विवरण, एचसीसी organoid निर्माण की पूरी प्रक्रिया के लिए व्यापक प्रोटोकॉल की कमी, और आम तौर पर सुसंस्कृत organoids 6,7,8 के छोटे आकार शामिल हैं. सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स के आम तौर पर सीमित आयामों के प्रकाश में, हमने एचसीसी ऑर्गेनॉइड निर्माण6 की संपूर्णता को शामिल करते हुए एक व्यापक प्रोटोकॉल के विकास के माध्यम से इन चुनौतियों से निपटने का प्रयास किया। इस प्रोटोकॉल में ऊतक पृथक्करण, ऑर्गेनॉइड चढ़ाना, संस्कृति, पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन शामिल हैं। प्रक्रियात्मक चरणों का अनुकूलन और संस्कृति माध्यम की संरचना को परिष्कृत करके, हमने एचसीसी ऑर्गेनॉइड मॉडल को सफलतापूर्वक स्थापित किया है जो निरंतर विकास और दीर्घकालिक पासिंग 6,8 में सक्षम हैं। बाद के खंडों में, एचसीसी ऑर्गेनोइड के निर्माण में शामिल परिचालन जटिलताओं और प्रासंगिक कारकों का एक व्यापक खाता प्रस्तुत किया जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल का एक उल्लेखनीय लाभ ट्यूमर की जैविक विशेषताओं को ईमानदारी से दोहराने, ऊतक संरचना और जीनोमिक परिदृश्य को शामिल करने की उनकी क्षमता में निहित है। ये मॉडल सटीकता का एक उल्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (82122048; 82003773; 82203380) और ग्वांगडोंग बेसिक एंड एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (2023A1515011416) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Riferimenti
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