Desarrollo y optimización de un modelo de organoide derivado de pacientes con carcinoma hepatocelular humano para la identificación de posibles dianas y el descubrimiento de fármacos
Summary
Proporcionamos una visión general completa y el perfeccionamiento de los protocolos existentes para la formación de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), que abarcan todas las etapas del cultivo de organoides. Este sistema sirve como un modelo valioso para la identificación de posibles dianas terapéuticas y la evaluación de la eficacia de los candidatos a fármacos.
Abstract
El carcinoma hepatocelular (CHC) es un tumor altamente prevalente y letal en todo el mundo, y su descubrimiento tardío y la falta de agentes terapéuticos específicos eficaces requieren más investigación sobre su patogénesis y tratamiento. Los organoides, un modelo novedoso que se asemeja mucho al tejido tumoral nativo y que puede cultivarse in vitro, han despertado un gran interés en los últimos años, con numerosos informes sobre el desarrollo de modelos organoides para el cáncer de hígado. En este estudio, hemos optimizado con éxito el procedimiento y establecido un protocolo de cultivo que permite la formación de organoides de HCC de mayor tamaño con condiciones estables de paso y cultivo. Hemos descrito exhaustivamente cada paso del procedimiento, cubriendo todo el proceso de disociación del tejido del CHC, la siembra de organoides, el cultivo, el paseo, la criopreservación y la reanimación, y hemos proporcionado precauciones detalladas en este documento. Estos organoides exhiben similitud genética con los tejidos originales del CHC y se pueden utilizar para diversas aplicaciones, incluida la identificación de posibles dianas terapéuticas para tumores y el posterior desarrollo de fármacos.
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC), un tumor prevalente y muy diverso1, ha atraído una atención considerable dentro de la comunidad médica. La presencia de plasticidad de linaje y heterogeneidad sustancial en el CHC sugiere que las células tumorales que se originan en varios pacientes e incluso lesiones distintas dentro del mismo paciente pueden manifestar rasgos moleculares y fenotípicos diferentes, lo que presenta obstáculos formidables en el avance de enfoques terapéuticos innovadores 2,3,4,5 . En consecuencia, existe una necesidad imperiosa de mejorar la comprensión de los atributos biológicos y los mecanismos de la resistencia a los medicamentos en el CHC para informar la formulación de estrategias de tratamiento más eficaces.
En las últimas décadas, los investigadores han dedicado sus esfuerzos al desarrollo de modelos in vitro con el fin de estudiar el HCC 3,4. A pesar de algunos avances, persisten las limitaciones. Estos modelos abarcan una variedad de técnicas, como la utilización de líneas celulares, células primarias y xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Las líneas celulares sirven como modelos in vitro para el cultivo a largo plazo de células tumorales obtenidas de pacientes con CHC, lo que ofrece los beneficios de la conveniencia y la expansión fácil. Los modelos celulares primarios implican el aislamiento y cultivo directo de células tumorales primarias de los tejidos tumorales de los pacientes, lo que proporciona una representación de las características biológicas que se asemejan mucho a las de los propios pacientes. Los modelos PDX implican el trasplante de tejidos tumorales de pacientes en ratones, con el objetivo de simular más fielmente el crecimiento y la respuesta tumoral. Estos modelos han sido fundamentales en la investigación del CHC, pero poseen ciertas limitaciones, incluida la heterogeneidad de las líneas celulares y la incapacidad de replicarse completamente en condiciones in vivo. Además, el cultivo in vitro prolongado puede provocar el deterioro de las características y funcionalidades originales de las células, lo que plantea dificultades para representar con precisión las propiedades biológicas del CHC. Además, la utilización de los modelos PDX requiere mucho tiempo y es costosa3.
Para abordar estas limitaciones y replicar con mayor precisión los atributos fisiológicos del CHC, se ha introducido la utilización de la tecnología de organoides como una plataforma de investigación prometedora capaz de superar las limitaciones anteriores. Los organoides, que son modelos celulares tridimensionales cultivados in vitro, tienen la capacidad de replicar la estructura y funcionalidad de los órganos reales. Sin embargo, en el contexto del CHC, existen ciertos desafíos en el establecimiento de modelos de organoides. Estos desafíos incluyen descripciones insuficientemente detalladas de los procedimientos de construcción de organoides de HCC, la falta de protocolos integrales para todo el proceso de construcción de organoides de HCC y el tamaño típicamente pequeño de los organoides cultivados 6,7,8. A la luz de las dimensiones típicamente limitadas de los organoides cultivados, nos esforzamos por abordar estos desafíos mediante el desarrollo de un protocolo integral que abarque la totalidad de la construcción de organoides HCC6. Este protocolo abarca la disociación de tejidos, la colocación de placas en organoides, el cultivo, el pase, la criopreservación y la reanimación. Al optimizar los pasos del procedimiento y refinar la composición del medio de cultivo, hemos establecido con éxito modelos de organoides HCC capaces de un crecimiento sostenido y un paso a largo plazo 6,8. En las secciones siguientes, se presentará una descripción completa de las complejidades operativas y los factores pertinentes que intervienen en la construcción de organoides de HCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un beneficio notable de los modelos de organoides derivados de pacientes radica en su capacidad para replicar fielmente las características biológicas de los tumores, abarcando la estructura del tejido y el paisaje genómico. Estos modelos demuestran un notable nivel de precisión y reflejan eficazmente la heterogeneidad y progresión de los tumores, incluso durante largos períodos de cultivo 6,8,9. A través de la utilizaci?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82122048; 82003773; 82203380) y la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (2023A1515011416).
Materials
| [Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
| Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexamethasone | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
| Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Forceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
| N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamide | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
| Surgical scissors | N/A | N/A | |
| Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
| Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Riferimenti
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