Vi tillhandahåller en omfattande översikt och förfining av befintliga protokoll för organoidbildning av hepatocellulärt karcinom (HCC), som omfattar alla stadier av organoidodling. Detta system fungerar som en värdefull modell för identifiering av potentiella terapeutiska mål och bedömning av läkemedelskandidaters effektivitet.
Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en mycket utbredd och dödlig tumör över hela världen och dess sena upptäckt och brist på effektiva specifika terapeutiska medel kräver ytterligare forskning om dess patogenes och behandling. Organoider, en ny modell som liknar naturlig tumörvävnad och kan odlas in vitro, har väckt stort intresse de senaste åren, med många rapporter om utvecklingen av organoidmodeller för levercancer. I denna studie har vi framgångsrikt optimerat proceduren och etablerat ett odlingsprotokoll som möjliggör bildandet av större HCC-organoider med stabila passage- och odlingsförhållanden. Vi har utförligt beskrivit varje steg i proceduren, som täcker hela processen med HCC-vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning, och tillhandahållit detaljerade försiktighetsåtgärder i detta dokument. Dessa organoider uppvisar genetisk likhet med de ursprungliga HCC-vävnaderna och kan användas för olika tillämpningar, inklusive identifiering av potentiella terapeutiska mål för tumörer och efterföljande läkemedelsutveckling.
Hepatocellulärt karcinom (HCC), en utbredd och mycket varierad tumör1, har fått stor uppmärksamhet inom det medicinska samfundet. Förekomsten av härstamningsplasticitet och betydande heterogenitet i HCC tyder på att tumörceller som härrör från olika patienter och till och med distinkta lesioner inom samma patient kan uppvisa olika molekylära och fenotypiska egenskaper, vilket utgör formidabla hinder för utvecklingen av innovativa terapeutiska metoder 2,3,4,5 . Följaktligen finns det ett absolut behov av ökad förståelse av de biologiska egenskaperna och mekanismerna för läkemedelsresistens vid HCC för att informera formuleringen av mer effektiva behandlingsstrategier.
Under de senaste decennierna har forskare ägnat sina ansträngningar åt att utveckla in vitro-modeller i syfte att studera HCC 3,4. Trots vissa framsteg kvarstår begränsningarna. Dessa modeller omfattar en rad olika tekniker, såsom användning av cellinjer, primära celler och patient-deriverade xenografter (PDX). Cellinjer fungerar som in vitro-modeller för långtidsodling av tumörceller erhållna från HCC-patienter, vilket ger fördelarna med bekvämlighet och enkel expansion. Primära cellmodeller innebär direkt isolering och odling av primära tumörceller från patientens tumörvävnad, vilket ger en representation av biologiska egenskaper som liknar patienterna själva. PDX-modeller innebär transplantation av tumörvävnad från patienter till möss, i syfte att mer exakt simulera tumörtillväxt och respons. Dessa modeller har varit avgörande för HCC-forskning, men de har vissa begränsningar, inklusive cellinjernas heterogenitet och oförmågan att fullt ut replikera in vivo-förhållanden. Dessutom kan långvarig in vitro-odling leda till försämring av cellernas ursprungliga egenskaper och funktioner, vilket innebär utmaningar när det gäller att korrekt representera de biologiska egenskaperna hos HCC. Dessutom är användningen av PDX-modeller både tidskrävande och kostsam3.
För att ta itu med dessa begränsningar och mer exakt replikera de fysiologiska egenskaperna hos HCC har användningen av organoidteknik introducerats som en lovande forskningsplattform som kan överträffa tidigare begränsningar. Organoider, som är tredimensionella cellmodeller odlade in vitro, har förmågan att replikera strukturen och funktionaliteten hos faktiska organ. I samband med HCC finns det dock vissa utmaningar med att etablera organoidmodeller. Dessa utmaningar inkluderar otillräckligt detaljerade beskrivningar av HCC-organoidkonstruktionsprocedurer, brist på omfattande protokoll för hela processen för HCC-organoidkonstruktion och den vanligtvis lilla storleken på odlade organoider 6,7,8. Mot bakgrund av de vanligtvis begränsade dimensionerna av odlade organoider, strävade vi efter att ta itu med dessa utmaningar genom att utveckla ett omfattande protokoll som omfattar hela HCC-organoidkonstruktion6. Detta protokoll omfattar vävnadsdissociation, organoidplätering, odling, passaging, kryokonservering och återupplivning. Genom att optimera procedurstegen och förfina sammansättningen av odlingsmediet har vi framgångsrikt etablerat HCC-organoidmodeller som kan upprätthålla tillväxt och långsiktig passage 6,8. I de följande avsnitten kommer en omfattande redogörelse för de operativa krångligheterna och relevanta faktorer som är involverade i konstruktionen av HCC-organoider att presenteras.
En anmärkningsvärd fördel med patienthärledda organoidmodeller ligger i deras förmåga att troget replikera de biologiska egenskaperna hos tumörer, vilket omfattar vävnadsstruktur och genomiskt landskap. Dessa modeller uppvisar en anmärkningsvärd nivå av noggrannhet och speglar effektivt heterogeniteten och progressionen av tumörer, även under längre perioder av odling 6,8,9. Genom att använda detta förfinade orga…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) och Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).
[Leu15]-gastrin I human | Merck | G9145 | |
1.5 mL Microtubes | Merck | AXYMCT150LC | |
A8301 (TGFβ inhibitor) | Tocris Bioscience | 2939 | |
B27 Supplement (503), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (503), serum-free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
Cell strainer size 100 μm | Merck | CLS352360 | |
CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3473 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3471 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D SYSTEMS | 3700-100-01 | Organoid harvesting solution |
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
DAPT | Merck | D5942 | |
Dexamethasone | Merck | D4902 | |
DMSO | Merck | C6164 | |
DNaseI | Merck | DN25 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM/F-12 |
Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
Forceps | N/A | N/A | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope | Leica | N/A | |
N2 supplement (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
N-acetylcysteine | Merck | A0737-5MG | |
Nicotinamide | Merck | N0636 | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride | Merck | Y0503 | |
R-spodin1-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |
Surgical scissors | N/A | N/A | |
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients | Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University | N/A | |
TNFα | Peprotech | 315-01A | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Trypsin substitute |
Wnt-3a-conditioned medium | (Broutier et al.) | N/A | Secretion of cell lines |