Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche

Elena Levi-D’Ancona; Vaibhav Sidarala; Scott A. Soleimanpour

doi:10.3791/65789

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Articolo metodologico

Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche

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DOI:

10.3791/65789

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15 settembre 2023

Elena Levi-D’Ancona¹^,² , Vaibhav Sidarala¹ , Scott A. Soleimanpour¹^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴VA Ann Arbor Healthcare System

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea due metodi per l'analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche: in primo luogo, una combinazione di coloranti specifici per mitocondri permeabili alle cellule e, in secondo luogo, un reporter mitofagico geneticamente codificato. Queste due tecniche sono complementari e possono essere implementate in base a esigenze specifiche, consentendo flessibilità e precisione nell'affrontare quantitativamente il controllo di qualità mitocondriale.

Abstract

La mitofagia è un meccanismo di controllo della qualità necessario per mantenere una funzione mitocondriale ottimale. La mitofagia disfunzionale a β cellule provoca un rilascio insufficiente di insulina. Le valutazioni quantitative avanzate della mitofagia spesso richiedono l'uso di reporter genetici. Il modello murino mt-Keima, che esprime una sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mirata ai mitocondri per quantificare la mitofagia tramite citometria a flusso, è stato ottimizzato in cellule β. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d'onda mt-Keima può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia. Tuttavia, l'utilizzo di reporter di mitofagia genetica può essere difficile quando si lavora con modelli murini genetici complessi o cellule difficili da trasfettare, come le isole umane primarie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo complementare basato su coloranti per quantificare la mitofagia a β cellule nelle isole primarie utilizzando MtPhagy. La mtfagia è un colorante sensibile al pH e permeabile alle cellule che si accumula nei mitocondri e aumenta la sua intensità di fluorescenza quando i mitocondri si trovano in ambienti a basso pH, come i lisosomi durante la mitofagia. Combinando il colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicatore Zn²⁺ che seleziona le cellule β, e Tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE) per valutare il potenziale di membrana mitocondriale, il flusso mitofagico può essere quantificato in modo specifico nelle cellule β tramite citometria a flusso. Questi due approcci sono altamente complementari e consentono flessibilità e precisione nella valutazione del controllo di qualità mitocondriale in numerosi modelli di cellule β.

Introduzione

Le cellule β pancreatiche producono e secernono insulina per soddisfare le richieste metaboliche e la disfunzione delle cellule β è responsabile dell'iperglicemia e dell'insorgenza del diabete sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2. Le cellule β accoppiano il metabolismo del glucosio con la secrezione di insulina attraverso l'energetica mitocondriale e l'output metabolico, che dipendono da una riserva di massa mitocondriale funzionale ^1,2,3. Per mantenere una funzione ottimale delle cellule β, le cellule β si affidano a meccanismi di controllo della qualità mitocon....