Approcci complementari per interrogare il flusso mitofagico nelle cellule β pancreatiche
Summary
Questo protocollo delinea due metodi per l’analisi quantitativa della mitofagia nelle cellule β pancreatiche: in primo luogo, una combinazione di coloranti specifici per mitocondri permeabili alle cellule e, in secondo luogo, un reporter mitofagico geneticamente codificato. Queste due tecniche sono complementari e possono essere implementate in base a esigenze specifiche, consentendo flessibilità e precisione nell’affrontare quantitativamente il controllo di qualità mitocondriale.
Abstract
La mitofagia è un meccanismo di controllo della qualità necessario per mantenere una funzione mitocondriale ottimale. La mitofagia disfunzionale a β cellule provoca un rilascio insufficiente di insulina. Le valutazioni quantitative avanzate della mitofagia spesso richiedono l’uso di reporter genetici. Il modello murino mt-Keima, che esprime una sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mirata ai mitocondri per quantificare la mitofagia tramite citometria a flusso, è stato ottimizzato in cellule β. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d’onda mt-Keima può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia. Tuttavia, l’utilizzo di reporter di mitofagia genetica può essere difficile quando si lavora con modelli murini genetici complessi o cellule difficili da trasfettare, come le isole umane primarie. Questo protocollo descrive un nuovo metodo complementare basato su coloranti per quantificare la mitofagia a β cellule nelle isole primarie utilizzando MtPhagy. La mtfagia è un colorante sensibile al pH e permeabile alle cellule che si accumula nei mitocondri e aumenta la sua intensità di fluorescenza quando i mitocondri si trovano in ambienti a basso pH, come i lisosomi durante la mitofagia. Combinando il colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicatore Zn2+ che seleziona le cellule β, e Tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE) per valutare il potenziale di membrana mitocondriale, il flusso mitofagico può essere quantificato in modo specifico nelle cellule β tramite citometria a flusso. Questi due approcci sono altamente complementari e consentono flessibilità e precisione nella valutazione del controllo di qualità mitocondriale in numerosi modelli di cellule β.
Introduction
Le cellule β pancreatiche producono e secernono insulina per soddisfare le richieste metaboliche e la disfunzione delle cellule β è responsabile dell’iperglicemia e dell’insorgenza del diabete sia nel diabete di tipo 1 che in quello di tipo 2. Le cellule β accoppiano il metabolismo del glucosio con la secrezione di insulina attraverso l’energetica mitocondriale e l’output metabolico, che dipendono da una riserva di massa mitocondriale funzionale 1,2,3. Per mantenere una funzione ottimale delle cellule β, le cellule β si affidano a meccanismi di controllo della qualità mitocondriale per rimuovere i mitocondri invecchiati o danneggiati e preservare la massa mitocondriale funzionale4. L’autofagia mitocondriale selettiva, nota anche come mitofagia, è una componente chiave del percorso di controllo della qualità mitocondriale.
Le valutazioni della mitofagia nelle cellule vive spesso si basano sui cambiamenti del pH mitocondriale che si verificano durante la mitofagia. I mitocondri hanno un pH leggermente alcalino e i mitocondri sani risiedono normalmente nel citosol a pH neutro. Durante la mitofagia, i mitocondri danneggiati o disfunzionali vengono selettivamente incorporati negli autofagosomi e infine eliminati all’interno dei lisosomi acidi5. Diversi modelli murini reporter di mitofagia transgenica in vivo, come mt-Keima6, mitoQC7 e CMMR8, nonché sonde di mitofagia trasfettabili, come il plasmide Cox8-EGFP-mCherry9, utilizzano questa variazione di pH per fornire valutazioni quantitative della mitofagia. L’uso di topi transgenici che esprimono la sonda raziometrica a doppia eccitazione sensibile al pH mt-Keima è stato ottimizzato per le valutazioni della mitofagia nelle isole e nelle cellule β tramite citometria a flusso10,11. Il rapporto tra le emissioni acide e neutre della lunghezza d’onda mt-Keima (il rapporto tra l’eccitazione acida di 561 nm e quella neutra di 480 nm) può essere utilizzato per quantificare in modo robusto la mitofagia 6,12.
Questo protocollo descrive un approccio ottimizzato per valutare il flusso mitofagico nelle isole primarie e nelle cellule β isolate da topi transgenici mt-Keima 10,11. Sebbene mt-Keima sia una sonda altamente sensibile, richiede complicati schemi di allevamento animale o la trasfezione di cellule, che spesso possono essere difficili quando si lavora in combinazione con altri modelli genetici o con isole umane primarie. Inoltre, l’uso di laser e rivelatori a fluorescenza multipli per identificare popolazioni cellulari neutre e acide può limitare l’uso combinatorio di altri reporter fluorescenti.
Per superare queste sfide, questo protocollo descrive anche un metodo complementare, a canale fluorescente singolo, basato su coloranti per il rilevamento robusto della mitofagia in cellule β da isole di topo isolate. Questo approccio, denominato metodo MtPhagy, utilizza una combinazione di tre coloranti permeabili alle cellule per selezionare le cellule β, quantificare le popolazioni cellulari attivamente sottoposte a mitofagia e valutare contemporaneamente il potenziale di membrana mitocondriale (MMP o Δψm).
Il primo di questi coloranti è la Fluozin-3-AM, un indicatore Zn2+ permeabile alle cellule con un Ex/Em 494/516 nm13. Le isole di topo comprendono una popolazione eterogenea di cellule funzionalmente distinte, tra cui cellule α, β, δ e PP. Le cellule β comprendono circa l’80% delle cellule all’interno dell’isolotto di topo e possono essere distinte da altri tipi di cellule insulari a causa della loro elevata concentrazione di Zn2+ all’interno dei granuli di insulina14,15, consentendo l’identificazione delle cellule β come la popolazionead alto contenuto di Fluozin-3-AM. Il colorante MtPhagy, un colorante sensibile al pH che è immobilizzato sui mitocondri tramite un legame chimico ed emette una debole fluorescenza, è utilizzato anche in questo protocollo16. Dopo l’induzione della mitofagia, i mitocondri danneggiati vengono incorporati nel lisosoma acido e il colorante MtPhagy aumenta la sua intensità di fluorescenza all’interno dell’ambiente a basso pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Inoltre, la tetrametilrodamina, estere etilico (TMRE), viene utilizzata per valutare la MMP. TMRE è un colorante permeabile alle cellule carica positiva (Ex/Em 552/575 nm) che viene sequestrato dai mitocondri sani a causa della relativa carica negativa sostenuta dal loro potenziale di membrana17. I mitocondri danneggiati o malsani dissipano il loro potenziale di membrana, con conseguente diminuzione della capacità di sequestrare la TMRE. Utilizzando questi coloranti insieme, le cellule β sottoposte a mitofagia possono essere identificate comela bassa popolazione di Fluozinad altaMtPhagyad altoTMRE tramite citometria a flusso. Poiché la mitofagia è un processo dinamico piuttosto che statico, questo protocollo è stato ottimizzato per valutare il flusso mitofagico utilizzando valinomicina, uno ionoforo K+ che induce la mitofagia dopo la dissipazione di MMP18. Il confronto della mitofagia in presenza e assenza di valinomicina consente di valutare il flusso mitofagico in diversi gruppi di campioni.
La natura basata sul colorante dell’attuale approccio consente di estrapolarlo alle isole umane e ad altri tipi di cellule difficili da trasfettare e aggira la necessità di complicati schemi di allevamento degli animali, a differenza del protocollo mt-Keima. L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di quantificare la mitofagia nelle cellule β a livello di singola cellula attraverso due metodi indipendenti basati sulla citometria a flusso. Nel loro insieme, questo protocollo descrive due metodi potenti e complementari che consentono sia precisione che flessibilità nello studio quantitativo del controllo di qualità mitocondriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo ha descritto due metodi complementari per quantificare il flusso mitofagico nelle isole primarie di topo dissociate. Utilizzando il metodo mt-Keima, un aumento della mitofagia è stato quantificato come un aumento del rapporto tra cellule acide (561 nm) / neutre (405 nm), mentre nel metodo MtPhagi, l’aumento del flusso mitofagico è stato quantificato come un aumento della popolazione cellulare Fluozinad altoMtPhagyad altoTMREbasso . Questi metodi consentono valutazioni …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. riconosce il sostegno del NIH (T32-AI007413 e T32-AG000114). SAS riconosce il sostegno della JDRF (COE-2019-861), del NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), del Dipartimento degli affari dei veterani (I01 BX004444), della famiglia Brehm e della famiglia Anthony.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
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