Extraction de l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau et de tissus
Summary
Cet article décrit un protocole d’extraction de l’ADN des diatomées à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commun modifié.
Abstract
Le test des diatomées est un moyen auxiliaire essentiel dans la pratique médico-légale pour déterminer si le cadavre s’est noyé dans l’eau et pour déduire le lieu de la noyade. L’analyse des diatomées est également un élément de recherche important dans le domaine de l’environnement et du plancton. La technologie de test de biologie moléculaire des diatomées, qui se concentre sur l’ADN des diatomées en tant qu’objet de recherche principal, est une nouvelle méthode de test des diatomées. L’extraction de l’ADN des diatomées est la base des tests moléculaires des diatomées. À l’heure actuelle, les kits couramment utilisés pour l’extraction de l’ADN des diatomées sont coûteux, ce qui augmente le coût de la recherche connexe. Notre laboratoire a amélioré le kit général d’extraction rapide d’ADN génomique du sang total et a obtenu un effet d’extraction d’ADN de diatomée satisfaisant, fournissant ainsi une solution d’extraction d’ADN alternative économique et abordable à base de billes de verre pour la recherche connexe. L’ADN des diatomées extrait à l’aide de ce protocole pourrait satisfaire de nombreuses applications en aval, telles que la PCR et le séquençage.
Introduction
Dans la pratique médico-légale, il est essentiel de déterminer si un cadavre retrouvé dans l’eau en train de se noyer ou s’il a été jeté à l’eau après la mort est essentiel pour la bonne résolution de l’affaire1. C’est aussi l’une des questions difficiles qui doivent être résolues de toute urgence dans la pratique médico-légale2. Les diatomées sont abondantes dans le milieu naturel (en particulier dans l’eau)3,4. Au cours du processus de noyade, en raison de l’hypoxie et de la réponse au stress, les gens auront des mouvements respiratoires intenses et inhaleront une grande quantité de liquide de noyade. Par conséquent, les diatomées dans l’eau pénètrent dans les poumons avec le liquide de noyade, et certaines diatomées peuvent pénétrer dans la circulation sanguine à travers la barrière alvéolaire-capillaire et se propager aux organes internes avec le flux sanguin 5,6. La détection de diatomées dans les tissus internes et les organes tels que les poumons, le foie et la moelle osseuse est une preuve solide de noyade avant la mort 7,8. À l’heure actuelle, les tests médico-légaux des diatomées sont principalement basés sur des méthodes de tests morphologiques. Après une série de pré-digestion des tissus, les estimations morphologiques qualitatives et quantitatives des diatomées non digérées sont effectuées au microscope. Pendant cette période, des réactifs dangereux et peu respectueux de l’environnement tels que l’acide nitrique doivent être utilisés. Ce processus prend beaucoup de temps et exige des chercheurs qu’ils disposent d’une solide expertise taxonomique et d’une vaste expérience. Tout cela pose certains défis au personnel médico-légal9. La technologie de test d’ADN des diatomées est une nouvelle technologie de test des diatomées développée ces dernières années 10,11,12. Cette technologie permet d’identifier les espèces de diatomées en analysant la composition spécifique des séquences d’ADN des diatomées13,14. La technologie PCR et la technologie de séquençage sont des méthodes techniques couramment utilisées, mais leur base est l’extraction réussie de l’ADN des diatomées. Cependant, les diatomées ont une structure spéciale différente des autres organismes, ce qui rend leurs techniques d’extraction de l’ADN également différentes.
La paroi cellulaire de la diatomée a un degré élevé de silicification et son composant principal est le dioxyde de silicium 15,16,17. La paroi cellulaire siliceuse est très dure et doit être détruite avant d’extraire l’ADN. Les kits d’extraction d’ADN ordinaires sont souvent difficiles à utiliser directement pour l’extraction de l’ADN des diatomées car ils ne peuvent pas détruire la coquille siliceuse des diatomées18. Par conséquent, la destruction de la coquille siliceuse des diatomées est l’un des principaux problèmes techniques à résoudre dans l’extraction de l’ADN des diatomées.
Dans le même temps, étant donné que le nombre de diatomées contenues dans les échantillons de recherche médico-légale, qu’il s’agisse d’échantillons d’eau ou d’organes et de tissus de corps noyés, est souvent limité, il est nécessaire d’enrichir les diatomées. L’essence de l’enrichissement est la séparation des substances. Lorsque vous essayez de rassembler les diatomées, minimisez le contenu des autres composants matériels (composants interférents). Dans le domaine de la médecine légale, les laboratoires utilisent souvent des méthodes de centrifugation ou d’enrichissement par filtration membranaire pour séparer les cellules de diatomées19. Cependant, étant donné que l’équipement de pompage sous vide n’est pas largement utilisé, la méthode d’enrichissement membranaire n’est pas souvent utilisée dans les laboratoires médico-légaux primaires ordinaires. Ainsi, la méthode de centrifugation est encore couramment l’enrichissement en diatomées dans les laboratoires médico-légaux20.
L’extraction de l’ADN à partir de diatomées est actuellement utilisée principalement dans la pratique médico-légale, et son application présente des limites importantes. À l’heure actuelle, il existe peu de kits d’extraction d’ADN de diatomées utilisés en médecine légale sur le marché et ils sont généralement coûteux21. Cet article fournit une méthode améliorée d’extraction de l’ADN des diatomées, rendant l’extraction de l’ADN des diatomées simple, pratique et rentable. Cela augmente l’application des tests de biologie moléculaire ultérieurs des diatomées et peut mieux résoudre les problèmes liés à la noyade en médecine légale grâce aux tests de diatomées. Cette méthode brise les parois cellulaires siliceuses des diatomées en ajoutant des billes de verre et en fixant un moment approprié pour le vortex. De cette façon, la protéinase K et la solution de liaison lysent rapidement les cellules et inactivent diverses enzymes dans les cellules. L’ADN génomique est absorbé dans la membrane matricielle de la colonne d’adsorption et finalement élué par le tampon d’élution. Un tel kit amélioré d’extraction de gènes de sang total améliore l’effet d’extraction de l’ADN des diatomées du kit de sang dans les matériaux d’examen médico-légal, réduit le coût de l’extraction de l’ADN des diatomées dans la pratique médico-légale et peut être mieux appliqué à la recherche médico-légale de base.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules de diatomées sont protégées par des parois cellulaires siliceuses dures17, et cette structure doit être détruite pour extraire l’ADN des diatomées. Les kits ordinaires ne détruisent pas facilement la coquille siliceuse des diatomées ; il est donc difficile d’extraire avec succès l’ADN21 des diatomées. Notre laboratoire a amélioré le kit d’extraction d’ADN sanguin le plus couramment utilisé, en ajoutant des billes de verre de différents …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82060341,81560304) et par le projet de recherche scientifique de la plate-forme d’innovation académicienne de la province de Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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