В данной статье описан протокол экстракции ДНК диатомовых водорослей с использованием модифицированного общего набора для экстракции ДНК.
Диатомовые водоросли являются важным вспомогательным средством в судебно-медицинской практике для определения того, утонул ли труп в воде, и для определения места утопления. Тестирование диатомовых водорослей также является важным предметом исследований в области окружающей среды и планктона. Технология молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей, которая фокусируется на ДНК диатомовых водорослей в качестве основного объекта исследования, является новым методом тестирования диатомовых водорослей. Экстракция ДНК диатомовых водорослей является основой молекулярного тестирования диатомовых водорослей. В настоящее время наборы, обычно используемые для экстракции ДНК диатомовых водорослей, стоят дорого, что увеличивает стоимость проведения соответствующих исследований. Наша лаборатория усовершенствовала общий набор для быстрой экстракции геномной ДНК цельной крови и получила удовлетворительный эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей, тем самым предоставив альтернативное экономичное и доступное решение для экстракции ДНК на основе стеклянных шариков для соответствующих исследований. ДНК диатомовых водорослей, выделенная с помощью этого протокола, может удовлетворить многие последующие задачи, такие как ПЦР и секвенирование.
В судебно-медицинской практике определение того, был ли труп, найденный в воде утонувшим или брошенным в воду после смерти, имеет важное значение для надлежащего разрешения дела1. Это также один из сложных вопросов, которые необходимо срочно решить в судебно-экспертной практике2. Диатомовые водоросли в изобилии встречаются в природной среде (особенно в воде)3,4. В процессе утопления, из-за гипоксии и реакции на стресс, люди будут иметь интенсивные дыхательные движения и вдыхать большое количество тонущей жидкости. Поэтому диатомовые водоросли, находящиеся в воде, попадают в легкие вместе с тонущей жидкостью, а некоторые диатомовые водоросли могут попадать в кровоток через альвеолярно-капиллярный барьер и распространяться по внутренним органам с током крови 5,6. Обнаружение диатомовых водорослей во внутренних тканях и органах, таких как легкие, печень и костный мозг, является убедительным доказательством утопления перед смертью 7,8. В настоящее время судебно-медицинская экспертиза диатомовых водорослей в основном основана на морфологических методах тестирования. После серии предварительных расщеплений ткани под микроскопом проводят морфологические качественные и количественные оценки непереваренных диатомовых водорослей. В этот период необходимо использовать опасные и экологически небезопасные реагенты, такие как азотная кислота. Этот процесс занимает много времени и требует от исследователей солидных таксономических знаний и большого опыта. Все это создает определенные трудности для судебно-медицинского персонала9. Технология тестирования ДНК диатомовых водорослей – это новая технология тестирования диатомовых водорослей, разработанная в последние годы 10,11,12. Эта технология реализует видовую идентификацию диатомовых водорослей путем анализа специфического состава последовательности ДНК диатомовых водорослей13,14. Технология ПЦР и технология секвенирования являются широко используемыми техническими методами, но их основой является успешное извлечение ДНК из диатомовых водорослей. Однако диатомовые водоросли имеют особую структуру, отличную от других организмов, что делает их методы экстракции ДНК также различными.
Клеточная стенка диатомовых водорослей имеет высокую степень силицификации, а основным ее компонентом является диоксид кремния 15,16,17. Кремнистая клеточная стенка очень твердая, и она должна быть разрушена перед извлечением ДНК. Обычные наборы для экстракции ДНК часто трудно использовать непосредственно для экстракции ДНК диатомовых водорослей, поскольку они не могут разрушить кремнистую оболочку диатомовых водорослей18. Поэтому разрушение кремнистой оболочки диатомовых водорослей является одной из ключевых технических задач, которые необходимо решить при извлечении ДНК диатомовых водорослей.
В то же время, поскольку количество диатомовых водорослей, содержащихся в образцах судебно-медицинской экспертизы, будь то пробы воды или органы и ткани утонувших тел, часто ограничено, необходимо обогащать диатомовые водоросли. Суть обогащения заключается в разделении веществ. Пытаясь собрать диатомовые водоросли вместе, минимизируйте содержание других материальных компонентов (мешающих компонентов). В судебно-медицинской экспертизе лаборатории часто используют методы центрифугирования или мембранной фильтрации для разделения клеток диатомовых водорослей19. Однако, поскольку вакуумное насосное оборудование не получило широкого распространения, метод мембранного обогащения не часто используется в обычных первичных криминалистических лабораториях. Таким образом, метод центрифугирования по-прежнему широко распространен в криминалистических лабораторияхобогащением диатомовыми водорослями 20.
Выделение ДНК из диатомовых водорослей в настоящее время используется в основном в судебно-медицинской практике, и существуют существенные ограничения для его применения. В настоящее время на рынке мало наборов для экстракции диатомовой ДНК, используемых в криминалистике, и они, как правило, дорогие. В этой статье представлен усовершенствованный метод экстракции ДНК диатомовых водорослей, делающий экстракцию ДНК диатомовых водорослей простым, удобным и экономичным. Это расширяет применение последующего молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей и может лучше решать проблемы, связанные с утоплением в судебной медицине, с помощью тестирования диатомовых водорослей. Этот метод разрушает кремнистые клеточные стенки диатомовых водорослей, добавляя стеклянные шарики и устанавливая подходящее время для вихря. Таким образом, протеиназа К и связывающий раствор быстро лизируют клетки и инактивируют различные ферменты в клетках. Геномная ДНК поглощается матричной мембраной в адсорбционной колонке и, наконец, элюируется элюирующим буфером. Такой улучшенный набор для экстракции генов цельной крови улучшает эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей в материалах судебно-медицинской экспертизы, снижает стоимость экстракции ДНК диатомовых водорослей в судебно-медицинской практике и может быть лучше применен для низовых судебно-медицинских исследований.
Клетки диатомовых водорослей защищены твердыми кремнеземистыми клеточными стенками17, и эта структура должна быть разрушена для извлечения ДНК диатомовых водорослей. Обычные наборы не так легко разрушают кремнистую оболочку диатомовых водорослей; таким образом, трудно у…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82060341,81560304) и Научно-исследовательского проекта «Инновационная платформа академика» провинции Хайнань (YSPTZX202134).
Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |