Выделение ДНК диатомовых водорослей из проб воды и тканей
Summary
В данной статье описан протокол экстракции ДНК диатомовых водорослей с использованием модифицированного общего набора для экстракции ДНК.
Abstract
Диатомовые водоросли являются важным вспомогательным средством в судебно-медицинской практике для определения того, утонул ли труп в воде, и для определения места утопления. Тестирование диатомовых водорослей также является важным предметом исследований в области окружающей среды и планктона. Технология молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей, которая фокусируется на ДНК диатомовых водорослей в качестве основного объекта исследования, является новым методом тестирования диатомовых водорослей. Экстракция ДНК диатомовых водорослей является основой молекулярного тестирования диатомовых водорослей. В настоящее время наборы, обычно используемые для экстракции ДНК диатомовых водорослей, стоят дорого, что увеличивает стоимость проведения соответствующих исследований. Наша лаборатория усовершенствовала общий набор для быстрой экстракции геномной ДНК цельной крови и получила удовлетворительный эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей, тем самым предоставив альтернативное экономичное и доступное решение для экстракции ДНК на основе стеклянных шариков для соответствующих исследований. ДНК диатомовых водорослей, выделенная с помощью этого протокола, может удовлетворить многие последующие задачи, такие как ПЦР и секвенирование.
Introduction
В судебно-медицинской практике определение того, был ли труп, найденный в воде утонувшим или брошенным в воду после смерти, имеет важное значение для надлежащего разрешения дела1. Это также один из сложных вопросов, которые необходимо срочно решить в судебно-экспертной практике2. Диатомовые водоросли в изобилии встречаются в природной среде (особенно в воде)3,4. В процессе утопления, из-за гипоксии и реакции на стресс, люди будут иметь интенсивные дыхательные движения и вдыхать большое количество тонущей жидкости. Поэтому диатомовые водоросли, находящиеся в воде, попадают в легкие вместе с тонущей жидкостью, а некоторые диатомовые водоросли могут попадать в кровоток через альвеолярно-капиллярный барьер и распространяться по внутренним органам с током крови 5,6. Обнаружение диатомовых водорослей во внутренних тканях и органах, таких как легкие, печень и костный мозг, является убедительным доказательством утопления перед смертью 7,8. В настоящее время судебно-медицинская экспертиза диатомовых водорослей в основном основана на морфологических методах тестирования. После серии предварительных расщеплений ткани под микроскопом проводят морфологические качественные и количественные оценки непереваренных диатомовых водорослей. В этот период необходимо использовать опасные и экологически небезопасные реагенты, такие как азотная кислота. Этот процесс занимает много времени и требует от исследователей солидных таксономических знаний и большого опыта. Все это создает определенные трудности для судебно-медицинского персонала9. Технология тестирования ДНК диатомовых водорослей – это новая технология тестирования диатомовых водорослей, разработанная в последние годы 10,11,12. Эта технология реализует видовую идентификацию диатомовых водорослей путем анализа специфического состава последовательности ДНК диатомовых водорослей13,14. Технология ПЦР и технология секвенирования являются широко используемыми техническими методами, но их основой является успешное извлечение ДНК из диатомовых водорослей. Однако диатомовые водоросли имеют особую структуру, отличную от других организмов, что делает их методы экстракции ДНК также различными.
Клеточная стенка диатомовых водорослей имеет высокую степень силицификации, а основным ее компонентом является диоксид кремния 15,16,17. Кремнистая клеточная стенка очень твердая, и она должна быть разрушена перед извлечением ДНК. Обычные наборы для экстракции ДНК часто трудно использовать непосредственно для экстракции ДНК диатомовых водорослей, поскольку они не могут разрушить кремнистую оболочку диатомовых водорослей18. Поэтому разрушение кремнистой оболочки диатомовых водорослей является одной из ключевых технических задач, которые необходимо решить при извлечении ДНК диатомовых водорослей.
В то же время, поскольку количество диатомовых водорослей, содержащихся в образцах судебно-медицинской экспертизы, будь то пробы воды или органы и ткани утонувших тел, часто ограничено, необходимо обогащать диатомовые водоросли. Суть обогащения заключается в разделении веществ. Пытаясь собрать диатомовые водоросли вместе, минимизируйте содержание других материальных компонентов (мешающих компонентов). В судебно-медицинской экспертизе лаборатории часто используют методы центрифугирования или мембранной фильтрации для разделения клеток диатомовых водорослей19. Однако, поскольку вакуумное насосное оборудование не получило широкого распространения, метод мембранного обогащения не часто используется в обычных первичных криминалистических лабораториях. Таким образом, метод центрифугирования по-прежнему широко распространен в криминалистических лабораторияхобогащением диатомовыми водорослями 20.
Выделение ДНК из диатомовых водорослей в настоящее время используется в основном в судебно-медицинской практике, и существуют существенные ограничения для его применения. В настоящее время на рынке мало наборов для экстракции диатомовой ДНК, используемых в криминалистике, и они, как правило, дорогие. В этой статье представлен усовершенствованный метод экстракции ДНК диатомовых водорослей, делающий экстракцию ДНК диатомовых водорослей простым, удобным и экономичным. Это расширяет применение последующего молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей и может лучше решать проблемы, связанные с утоплением в судебной медицине, с помощью тестирования диатомовых водорослей. Этот метод разрушает кремнистые клеточные стенки диатомовых водорослей, добавляя стеклянные шарики и устанавливая подходящее время для вихря. Таким образом, протеиназа К и связывающий раствор быстро лизируют клетки и инактивируют различные ферменты в клетках. Геномная ДНК поглощается матричной мембраной в адсорбционной колонке и, наконец, элюируется элюирующим буфером. Такой улучшенный набор для экстракции генов цельной крови улучшает эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей в материалах судебно-медицинской экспертизы, снижает стоимость экстракции ДНК диатомовых водорослей в судебно-медицинской практике и может быть лучше применен для низовых судебно-медицинских исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клетки диатомовых водорослей защищены твердыми кремнеземистыми клеточными стенками17, и эта структура должна быть разрушена для извлечения ДНК диатомовых водорослей. Обычные наборы не так легко разрушают кремнистую оболочку диатомовых водорослей; таким образом, трудно у…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82060341,81560304) и Научно-исследовательского проекта «Инновационная платформа академика» провинции Хайнань (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
Riferimenti
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
