Extractie van diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.
Abstract
Diatomeeënonderzoek is een essentieel hulpmiddel in de forensische praktijk om te bepalen of het lijk in water is verdronken en om de verdrinkingslocatie af te leiden. Diatomeeëntesten is ook een belangrijke onderzoeksinhoud op het gebied van milieu en plankton. De diatomeeën moleculair biologische testtechnologie, die zich richt op diatomeeën-DNA als primair onderzoeksobject, is een nieuwe methode voor het testen van diatomeeën. Diatomeeën-DNA-extractie is de basis van moleculair testen van diatomeeën. Op dit moment zijn de kits die vaak worden gebruikt voor diatomeeën-DNA-extractie duur, wat de kosten van het uitvoeren van gerelateerd onderzoek verhoogt. Ons laboratorium verbeterde de algemene volbloed genomische DNA-snelextractiekit en verkreeg een bevredigend diatomeeën-DNA-extractie-effect, waardoor een alternatieve economische en betaalbare DNA-extractieoplossing wordt geboden op basis van glasparels voor gerelateerd onderzoek. Het diatomeeën-DNA dat met behulp van dit protocol wordt geëxtraheerd, zou kunnen voldoen aan veel stroomafwaartse toepassingen, zoals PCR en sequencing.
Introduction
In de forensische praktijk is het essentieel voor de goede afwikkeling vande zaak om vast te stellen of een lijk dat in het water is gevonden, te verdrinken of na de dood in het water is gegooid. Het is ook een van de moeilijke kwesties die dringend moeten worden opgelost in de forensische praktijk2. Diatomeeën zijn overvloedig aanwezig in de natuurlijke omgeving (vooral in water)3,4. Tijdens het verdrinkingsproces, als gevolg van hypoxie en stressreactie, zullen mensen intense ademhalingsbewegingen hebben en een grote hoeveelheid verdrinkingsvloeistof inademen. Daarom komen de diatomeeën in het water de longen binnen met de verdrinkingsvloeistof, en sommige diatomeeën kunnen via de alveolair-capillaire barrière in de bloedcirculatie terechtkomen en zich verspreiden naar inwendige organen met de bloedstroom 5,6. De detectie van diatomeeën in inwendige weefsels en organen zoals longen, lever en beenmerg is een sterk bewijs van verdrinking voor de dood 7,8. Momenteel is forensisch diatomeeënonderzoek voornamelijk gebaseerd op morfologische testmethoden. Na een reeks voorvertering van het weefsel worden de morfologische kwalitatieve en kwantitatieve schattingen van onverteerde diatomeeën onder de microscoop uitgevoerd. Gedurende deze periode moeten gevaarlijke en milieuonvriendelijke reagentia zoals salpeterzuur worden gebruikt. Dit proces is tijdrovend en vereist dat onderzoekers beschikken over solide taxonomische expertise en uitgebreide ervaring. Dit alles brengt bepaalde uitdagingen met zich mee voor het forensisch personeel9. Diatomeeën-DNA-testtechnologie is een nieuwe technologie voor diatomeeëntesten die de afgelopen jaren is ontwikkeld 10,11,12. Deze technologie realiseert de soortidentificatie van diatomeeën door de specifieke DNA-sequentiesamenstelling van diatomeeënte analyseren 13,14. PCR-technologie en sequencing-technologie zijn veelgebruikte technische methoden, maar hun basis is de succesvolle extractie van DNA uit diatomeeën. Diatomeeën hebben echter een speciale structuur die verschilt van andere organismen, waardoor hun DNA-extractietechnieken ook anders zijn.
De celwand van diatomeeën heeft een hoge mate van verkiezeling en het hoofdbestanddeel is siliciumdioxide 15,16,17. De kiezelcelwand is erg hard en moet worden vernietigd voordat het DNA wordt geëxtraheerd. Gewone DNA-extractiekits zijn vaak moeilijk direct te gebruiken voor de extractie van diatomeeën-DNA, omdat ze de kiezelhoudende schil van diatomeeën niet kunnen vernietigen18. Daarom is het vernietigen van de kiezelhoudende schil van diatomeeën een van de belangrijkste technische problemen die moeten worden opgelost bij het extraheren van diatomeeën-DNA.
Tegelijkertijd, aangezien het aantal diatomeeën in forensische onderzoeksmonsters, of het nu gaat om watermonsters of organen en weefsels van verdronken lichamen, vaak beperkt is, is het noodzakelijk om diatomeeën te verrijken. De essentie van verrijking is het scheiden van stoffen. Terwijl u diatomeeën probeert te verzamelen, minimaliseert u het gehalte aan andere materiële componenten (storende componenten). Bij forensisch werk gebruiken laboratoria vaak centrifugatie- of membraanfiltratieverrijkingsmethoden om diatomeeëncellen te scheiden19. Omdat vacuümpompapparatuur echter niet veel wordt gebruikt, wordt de membraanverrijkingsmethode niet vaak gebruikt in gewone primaire forensische laboratoria. De centrifugatiemethode is dus nog steeds gebruikelijk diatomeeënverrijking in forensische laboratoria20.
DNA-extractie uit diatomeeën wordt momenteel voornamelijk gebruikt in de forensische praktijk en er zijn aanzienlijke beperkingen aan de toepassing ervan. Op dit moment zijn er maar weinig diatomeeën-DNA-extractiekits op de markt die in de forensische wetenschap worden gebruikt en ze zijn over het algemeen duur21. Dit artikel biedt een verbeterde diatomeeën-DNA-extractiemethode, waardoor diatomeeën-DNA-extractie eenvoudig, handig en kosteneffectief wordt. Dit verhoogt de toepassing van latere moleculair-biologische tests van diatomeeën en kan problemen met betrekking tot verdrinking in de forensische geneeskunde beter oplossen door middel van diatomeeëntesten. Deze methode breekt de kiezelhoudende celwanden van diatomeeën door glasparels toe te voegen en een geschikte tijd voor vortex in te stellen. Op deze manier lyseren het proteïnase K en de bindingsoplossing de cellen snel en inactiveren ze verschillende enzymen in de cellen. Het genomische DNA wordt geabsorbeerd in het matrixmembraan in de adsorptiekolom en uiteindelijk geëlueerd door de elutiebuffer. Zo’n verbeterde volbloed genextractiekit verbetert het diatomeeën-DNA-extractie-effect van de bloedkit in forensisch onderzoeksmateriaal, verlaagt de kosten van diatomeeën-DNA-extractie in de forensische praktijk en kan beter worden toegepast op forensisch onderzoek aan de basis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diatomeeëncellen worden beschermd door harde kiezelhoudende celwanden17, en deze structuur moet worden vernietigd om diatomeeën-DNA te extraheren. Gewone kits vernietigen niet gemakkelijk de kiezelhoudende schil van diatomeeën; dus het is moeilijk om diatomeeën-DNA21 met succes te extraheren. Ons laboratorium verbeterde de meest gebruikte bloed-DNA-extractiekit door glasparels met verschillende diameters en verschillende massaverhoudingen toe te voegen tijdens het proce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) en door het Academician Innovation Platform Scientific Research Project van de provincie Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
Riferimenti
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
