Analyse multiomique de TMEM200A en tant que biomarqueur pancancéreux
Summary
Ici, un protocole est présenté dans lequel de multiples outils bioinformatiques sont combinés pour étudier les fonctions biologiques de TMEM200A dans le cancer. De plus, nous validons également expérimentalement les prédictions bioinformatiques.
Abstract
La protéine transmembranaire, TMEM200A, est connue pour être associée aux cancers humains et à l’infiltration immunitaire. Ici, nous avons évalué la fonction de TMEM200A dans les cancers courants par analyse multiomique et utilisé des cultures cellulaires in vitro de cellules gastriques pour vérifier les résultats. L’expression de TMEM200A dans plusieurs types de cancer humain a été évaluée à l’aide des données de séquençage de l’ARN de la base de données Xena de l’UCSC. L’analyse bioinformatique a révélé un rôle potentiel de TMEM200A en tant que biomarqueur diagnostique et pronostique.
Des cultures de lignées cellulaires gastriques et cancéreuses normales ont été cultivées et TMEM200A a été abattue. Les niveaux d’expression de TMEM200A ont été mesurés à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel et d’un transfert Western. Des études in vitro de perte de fonction ont ensuite été utilisées pour déterminer les rôles de la TMEM200A dans le comportement malin et la formation tumorale des cellules cancéreuses gastriques (GC). Des Western blots ont été utilisés pour évaluer l’effet de l’inhibition sur la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la voie de signalisation PI3K/AKT dans la GC. L’analyse bioinformatique a montré que TMEM200A était exprimée à des niveaux élevés dans la GC.
La prolifération des cellules GC a été inhibée par TMEM200A knockdown, qui a également diminué la vimentine, la N-cadhérine et les protéines Snai, et a inhibé la phosphorylation de l’AKT. La voie de signalisation PI3K/AKT semble également être impliquée dans la régulation médiée par TMEM200A du développement de la GC. Les résultats présentés ici suggèrent que TMEM200A régule le microenvironnement tumoral en affectant l’EMT. TMEM200A peut également affecter l’EMT par le biais de la signalisation PI3K/AKT, influençant ainsi le microenvironnement tumoral. Par conséquent, dans les pan-cancers, en particulier la GC, TMEM200A peut être un biomarqueur et un oncogène potentiel.
Introduction
Le cancer est devenu un problème de santé publique persistant mettant en danger la santé humaine dans le monde1en raison de ses taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde, ce qui représente un lourd fardeau financier et médical pour la société2. Des progrès significatifs dans le traitement du cancer ont été réalisés ces dernières années grâce à la découverte de marqueurs du cancer3, et les chercheurs ont mis au point de nouvelles méthodes de diagnostic et de nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cependant, certains patients atteints de cancer ont encore un mauvais pronostic en raison de facteurs tels que la résistance aux médicaments, les effets secondaires des médicaments et la sensibilité chimique4. Par conséquent, il est urgent d’identifier de nouveaux biomarqueurs pour le dépistage et le traitement des cancers à un stade précoce5.
Les protéines membranaires sont des protéines qui peuvent se lier et s’intégrer dans les cellules et les membranes des organites6. Celles-ci peuvent être regroupées en trois catégories en fonction de la force de liaison à la membrane et de leur emplacement : les protéines ancrées dans les lipides, les protéines intégrales et les protéines membranaires périphériques 7,8. Une protéine transmembranaire (TMEM) est une protéine membranaire intégrale constituée d’au moins un segment transmembranaire9, qui traverse complètement ou partiellement la membrane biologique.
Bien que les mécanismes d’action des protéines appartenant à la famille des TMEM ne soient pas bien compris, ces protéines sont connues pour être impliquées dans plusieurs types de cancers10. Plusieurs protéines TMEM sont associées à des phénotypes migratoires, prolifératifs et invasifs, et leur expression est souvent associée au pronostic11 du patient. Par conséquent, les membres de la famille TMEM sont devenus la cible de la recherche. Un examen complet des rapports existants sur le TMEM a révélé qu’ils sont principalement associés à la signalisation inter- et intracellulaire12, aux maladies liées au système immunitaire et à la tumorigenèse10. De nombreux TMEM possèdent également des fonctions physiologiques importantes, par exemple, les canaux ioniques dans la membrane plasmique, l’activation des voies de transduction du signal, ainsi que la médiation de la chimiotaxie cellulaire, de l’adhésion, de l’apoptose et de l’autophagie10. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que les protéines TMEM pourraient être des marqueurs pronostiques importants dans la détection et le traitement des tumeurs.
TMEM200A expression est significativement élevée dans le cancer gastrique (GC). L’expression plus élevée de TMEM200A13, qui a huit exons et une longueur totale de 77,536 kb sur le chromosome 6q23.1, a été liée à un mauvais pronostic de survie globale (SG) dans les cas de GC. Pourtant, les changements dans son expression ont rarement été rapportés dans les études en oncologie. Cet article compare et analyse l’utilité de l’TMEM200A en tant que cible thérapeutique et marqueur diagnostique de tumeur dans diverses études sur le cancer à l’aide de différents ensembles de données accessibles au public. Nous avons évalué l’efficacité de TMEM200A en tant que biomarqueur diagnostique et pronostique pancancéreux ainsi que ses niveaux d’expression dans divers types de cancer humain à l’aide de données de séquençage de l’ARN provenant des bases de données UCSC Xena et TCGA, ainsi que par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) et Western blot.
L’effet des niveaux d’expression de TMEM200A sur les taux de mutation, les processus de régulation, le diagnostic et le pronostic tumoral, l’infiltration immunitaire et l’immunothérapie a été étudié plus en détail à l’aide d’un mélange d’outils informatiques et de sites Web de données. Les bases de données CBioPortal et COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) ont été utilisées pour examiner les mutations dans TMEM200A. Les sites Web Sangerbox et TISIDB ont été utilisés pour comprendre comment TMEM200A influence l’infiltration immunitaire. L’outil en ligne TISCH (Tumor Immune Single Cell Center) et la base de données CancerSEA ont été utilisés pour étudier la fonction de TMEM200A. Enfin, pour évaluer l’impact de la TMEM200A sur le comportement malin et la fonction de développement tumoral des cellules GC, une expérience de perte de fonction a été menée dans un essai in vitro . De plus, un transfert Western a été effectué pour évaluer comment TMEM200A knockdown affectait la voie de signalisation PI3K/AKT et la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dans la GC.
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A appartient à une famille de TMEM qui est essentielle à la prolifération des cellules cancéreuses38. L’expression variable de la TMEM200A dans les différentes tumeurs malignes a reçu moins d’attention, et une enquête approfondie sur le cancer fait défaut. Cependant, les preuves continuent de s’accumuler, montrant que la famille des protéines transmembranaires TMEM peut être importante dans le maintien de la malignité des cellules cancéreuses grâce à de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82160550).
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
Riferimenti
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