पैन-कैंसर बायोमार्कर के रूप में TMEM200A का मल्टीओमिक्स विश्लेषण
Summary
यहां, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जिसमें कैंसर में TMEM200A के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए कई जैव सूचना संबंधी उपकरण संयुक्त होते हैं। इसके अलावा, हम प्रयोगात्मक रूप से जैव सूचना विज्ञान भविष्यवाणियों को भी मान्य करते हैं।
Abstract
ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, TMEM200A, मानव कैंसर और प्रतिरक्षा घुसपैठ से जुड़ा हुआ माना जाता है। यहां, हमने मल्टीओमिक्स विश्लेषण द्वारा आम कैंसर में TMEM200A के कार्य का आकलन किया और परिणामों को सत्यापित करने के लिए गैस्ट्रिक कोशिकाओं के इन विट्रो सेल संस्कृतियों में उपयोग किया। कई मानव कैंसर प्रकारों में TMEM200A की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन यूसीएससी ज़ेना डेटाबेस से आरएनए-सीक्यू डेटा का उपयोग करके किया गया था। जैव सूचना संबंधी विश्लेषण ने नैदानिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की संभावित भूमिका का खुलासा किया।
सामान्य गैस्ट्रिक और कैंसर सेल लाइनों की संस्कृतियों को उगाया गया और TMEM200A खटखटाया गया। TMEM200A के अभिव्यक्ति स्तर मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके मापा गया था। इन विट्रो लॉस-ऑफ-फंक्शन अध्ययनों का उपयोग तब गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) कोशिकाओं के घातक व्यवहार और ट्यूमर गठन में TMEM200A की भूमिकाओं को निर्धारित करने के लिए किया गया था। पश्चिमी धब्बों का उपयोग जीसी में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) और पीआई 3 के / एकेटी सिग्नलिंग मार्ग पर दस्तक के प्रभाव का आकलन करने के लिए किया गया था। जैव सूचना संबंधी विश्लेषण से पता चला है कि TMEM200A जीसी में उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था।
जीसी कोशिकाओं के प्रसार को TMEM200A नॉकडाउन द्वारा बाधित किया गया था, जिसने विमेंटिन, एन-कैडरिन और स्नाई प्रोटीन को भी कम कर दिया और एकेटी फॉस्फोराइलेशन को रोक दिया। PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग भी GC विकास के TMEM200A-मध्यस्थता विनियमन में शामिल दिखाई दिया। यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि TMEM200A ईएमटी को प्रभावित करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को नियंत्रित करता है। TMEM200A PI3K/AKT सिग्नलिंग के माध्यम से EMT को भी प्रभावित कर सकता है, इस प्रकार ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रभावित करता है। इसलिए, पैन-कैंसर में, विशेष रूप से जीसी, TMEM200A एक संभावित बायोमार्कर और ऑन्कोजीन हो सकता है।
Introduction
कैंसरदुनिया भर मेंअपनी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के कारण विश्व स्तर पर मानव स्वास्थ्य को खतरे में डालने वाले एक लगातार सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दे के रूप में उभरा है, जिससे समाज पर भारी वित्तीय और चिकित्सा बोझ पैदा हो रहाहै। कैंसर मार्करों3 की खोज के लिए हाल के वर्षों में कैंसर चिकित्सा में महत्वपूर्ण प्रगति हासिल की गई है, और शोधकर्ताओं ने कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास नैदानिक विधियों और नई दवाओं का विकास किया है। हालांकि, कैंसर वाले कुछ रोगियों में अभी भी दवा प्रतिरोध, दवाओं के साइड इफेक्ट, और रासायनिक संवेदनशीलताजैसे कारकों के कारण खराब पूर्वानुमान हैं। इसलिए, प्रारंभिक चरण के कैंसर की स्क्रीनिंग और उपचार के लिए नए बायोमार्कर की पहचानकरने की तत्काल आवश्यकता है।
झिल्ली प्रोटीन है कि बाँध सकते हैं और कोशिकाओं और organelle झिल्ली 6 में एकीकृत कररहे हैं. ये झिल्ली और उनके स्थान के लिए बाध्यकारी की ताकत के आधार पर तीन श्रेणियों में बांटा जा सकता है: लिपिड-लंगर प्रोटीन, अभिन्न प्रोटीन, और परिधीय झिल्ली प्रोटीन 7,8. एक ट्रांसमेम्ब्रेन (टीएमईएम) प्रोटीन एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन है जिसमें कम से कम एक ट्रांसमेम्ब्रेन खंड9 होता है, जो जैविक झिल्ली के माध्यम से पूरी तरह या आंशिक रूप से गुजरता है।
हालांकि टीएमईएम परिवार से संबंधित प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं जाता है, इन प्रोटीनों को कई प्रकार के कैंसर10 में शामिल होने के लिए जाना जाता है। कई टीएमईएम प्रोटीन प्रवासी, प्रोलिफेरेटिव और इनवेसिव फेनोटाइप से जुड़े होते हैं, और उनकी अभिव्यक्ति अक्सर रोगी के पूर्वानुमान11 से जुड़ी होती है। इसलिए, टीएमईएम परिवार के सदस्य अनुसंधान का लक्ष्य बन गए हैं। टीएमईएम पर मौजूदा रिपोर्टों की एक व्यापक समीक्षा से पता चला कि वे ज्यादातर अंतर- और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग12, प्रतिरक्षा संबंधी बीमारियों और ट्यूमरजेनेसिस10 से जुड़े हैं। कई टीएमईएम में महत्वपूर्ण शारीरिक कार्य भी होते हैं, उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली में आयन चैनल, सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों की सक्रियता, साथ ही सेल केमोटैक्सिस, आसंजन, एपोप्टोसिस और ऑटोफैगी10 की मध्यस्थता। इसलिए, हमने अनुमान लगाया कि टीएमईएम प्रोटीन ट्यूमर का पता लगाने और उपचार में महत्वपूर्ण रोगनिरोधी मार्कर हो सकते हैं।
गैस्ट्रिक कैंसर (जीसी) में TMEM200A अभिव्यक्ति काफी बढ़ जाती है। TMEM200A13 की उच्च अभिव्यक्ति, जिसमें गुणसूत्र 6q23.1 पर आठ एक्सॉन और 77.536 kb की पूरी लंबाई है, को GC के मामलों में समग्र अस्तित्व (OS) के लिए खराब पूर्वानुमान से जोड़ा गया है। फिर भी ऑन्कोलॉजी अध्ययनों में इसकी अभिव्यक्ति में परिवर्तन शायद ही कभी रिपोर्ट किए गए हैं। यह लेख विभिन्न सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटासेट का उपयोग करके विभिन्न कैंसर अध्ययनों में चिकित्सीय लक्ष्य और ट्यूमर डायग्नोस्टिक मार्कर के रूप में TMEM200A की उपयोगिता की तुलना और विश्लेषण करता है। हमने पैन-कैंसर डायग्नोस्टिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर के रूप में TMEM200A की प्रभावशीलता का आकलन किया, साथ ही यूसीएससी ज़ेना और टीसीजीए डेटाबेस से आरएनए-सीक्यू डेटा का उपयोग करके विभिन्न मानव कैंसर प्रकारों में इसकी अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन किया, साथ ही साथ वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) और पश्चिमी सोख्ता।
उत्परिवर्तन दरों, नियामक प्रक्रियाओं, ट्यूमर निदान और रोग का निदान, प्रतिरक्षा घुसपैठ, और इम्यूनोथेरेपी पर TMEM200A अभिव्यक्ति के स्तर के प्रभाव की आगे कम्प्यूटेशनल टूल और डेटासेट वेबसाइटों के मिश्रण का उपयोग करके जांच की गई थी। CBioPortal और कैटलॉग ऑफ़ सोमैटिक म्यूटेशन इन कैंसर सेल्स (COSMIC) डेटाबेस का उपयोग TMEM200A में उत्परिवर्तन की जांच करने के लिए किया गया था। सेंगरबॉक्स और टीआईएसआईडीबी वेबसाइटों का उपयोग यह समझने के लिए किया गया था कि TMEM200A प्रतिरक्षा घुसपैठ को कैसे प्रभावित करता है। ट्यूमर इम्यून सिंगल सेल सेंटर (TISCH) ऑनलाइन टूल और CancerSEA डेटाबेस का उपयोग TMEM200A के कार्य की जांच के लिए किया गया था। अंत में, जीसी कोशिकाओं के घातक व्यवहार और ट्यूमर विकास समारोह पर TMEM200A के प्रभाव का आकलन करने के लिए, इन विट्रो परख में एक हानि-कार्य प्रयोग आयोजित किया गया था। इसके अतिरिक्त, पश्चिमी सोख्ता का आकलन करने TMEM200A लिए किया गया था कि कैसे नॉकडाउन ने PI3K/AKT सिग्नलिंग मार्ग और GC में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (EMT) को प्रभावित किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A टीएमईएम के एक परिवार से संबंधित है जो कैंसर कोशिकाओं के प्रसार के लिएआवश्यक है। विभिन्न विकृतियों में TMEM200A की परिवर्तनशील अभिव्यक्ति पर कम ध्यान दिया गया है, और पूरी तरह से पैन-कैंसर …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82160550) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
Riferimenti
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