Murine bagben explant model til undersøgelse af mekanobiologi af akillesseneimpingement

Summary

Vi præsenterer en brugerdefineret eksperimentel platform og vævskulturprotokol, der genskaber fibrocartilaginøs forandring drevet af impingement af akillesseneindsættelsen i murine bagekstremiteter med vedvarende cellelevedygtighed, hvilket giver en model, der er egnet til at udforske mekanobiologien af senepåvirkning.

Abstract

Senens påvirkning af knoglen genererer et multiaksialt mekanisk belastningsmiljø med markant forhøjet tværgående trykstamme, som fremkalder en lokaliseret fibrocartilagefænotype karakteriseret ved akkumulering af glycosaminoglycan (GAG) -rig matrix og ombygning af kollagennetværket. Mens fibrocartilage er et normalt træk i impinged regioner af sunde sener, overskydende GAG aflejring og disorganisering af kollagen netværk er kendetegnende træk ved tendinopati. Følgelig er impingement klinisk anerkendt som en vigtig ydre faktor i initiering og progression af tendinopati. Ikke desto mindre er mekanobiologien, der ligger til grund for senepåvirkning, stadig underundersøgt. Tidligere bestræbelser på at belyse det cellulære respons på senepåvirkning har anvendt uniaxial kompression på celler og udskåret seneeksplanter in vitro. Imidlertid mangler isolerede celler et tredimensionelt ekstracellulært miljø, der er afgørende for mekanorespons, og både in vitro og udskårne eksplantatundersøgelser undlader at rekapitulere det multiaksiale belastningsmiljø, der genereres af senepåvirkning in vivo, hvilket afhænger af anatomiske træk i det impingerede område. Desuden mangler in vivo-modeller af senepåvirkning kontrol over det mekaniske belastningsmiljø. For at overvinde disse begrænsninger præsenterer vi en ny murine bagbenseksplanteringsmodel, der er egnet til at studere mekanobiologien af akillessenepåvirkning. Denne model opretholder akillessenen in situ for at bevare lokal anatomi og reproducerer det multiaksiale belastningsmiljø, der genereres ved påvirkning af akillesseneindsættelsen på calcaneus under passivt påført ankeldorsiflexion, mens cellerne bevares i deres oprindelige miljø. Vi beskriver en vævskulturprotokol, der er integreret i denne model, og præsenterer data, der etablerer vedvarende eksplanteringslevedygtighed over 7 dage. De repræsentative resultater viser forbedret histologisk GAG-farvning og nedsat kollagenfiberjustering sekundært til impingement, hvilket tyder på forhøjet fibrocartilagedannelse. Denne model kan let tilpasses til at undersøge forskellige mekaniske belastningsregimer og giver mulighed for manipulation af molekylære veje af interesse for at identificere mekanismer, der medierer fænotypisk ændring i akillessenen som reaktion på impingement.

Introduction

Et væld af sener, herunder akillessenen og rotatormanchetsenerne, oplever knoglepåvirkning på grund af normal anatomisk positionering^1,2,3,4. Senimpingement genererer trykbelastning rettet på tværs til den langsgående fiberakse^5,6,7. Regioner af senepåvirkning demonstrerer en unik fibrocartilagefænotype, hvor krympede, runde celler (fibrochondrocytter) er indlejret i et uorganiseret kollagennetværk med markant øget glycosaminoglycan (GAG) indhold^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Tidligere undersøgelser tyder på, at det forskellige mekaniske miljø produceret af senepåvirkning opretholder denne GAG-rige matrix ved at drive aflejringen af store aggregerede proteoglycaner, især aggrecan, selvom de underliggende mekanismer er uklare^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Mens fibrocartilage er et normalt træk i impinged regioner af sunde sener, afvigende proteoglycan metabolisme forbundet med overdreven fibrocartilage dannelse er et kendetegnende træk ved tendinopati, en almindelig og invaliderende sygdom, der uforholdsmæssigt opstår i kronisk impinged sener^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. Derfor er senepåvirkning klinisk anerkendt som en vigtig ydre faktor, der driver flere af de mest almindelige sendinopatier, herunder rotatormanchetsygdom og insertionel akillessendinopati (IAT)^50,51,52. I øjeblikket er behandling af tendinopati ineffektiv. For eksempel kræver ca. 47% af patienterne med IAT kirurgisk indgreb efter mislykket konservativ behandling med variable postoperative resultater^53,54,55,56. På trods af det tilsyneladende forhold mellem impingement og tendinopati er de mekanobiologiske mekanismer, hvormed celler i impinged senesans og reagerer på deres mekaniske miljø, dårligt beskrevet, hvilket slører forståelsen af tendinopatipatogenese og resulterer i utilstrækkelig behandling.

Explant modeller er nyttige værktøjer i undersøgelsen af senemekanobiologi^57,58. Som et første skridt i retning af at forstå mekanobiologien af senepåvirkning har flere tidligere undersøgelser undersøgt cellulær respons efter anvendelse af simpel uniaxial kompression på celler eller udskåret seneeksplanter 27,29,30,31,32,33,34,39. Imidlertid mangler celler in vitro ekstracellulære og pericellulære matricer, der letter belastningsoverførsel, sekvestrerer vigtige vækstfaktorer og cytokiner frigivet ved mekanisk deformation og tilvejebringer substrat for fokale adhæsionskomplekser, der spiller en rolle i mekanotransduktion^57,59. Derudover kan hverken in vitro– og exciserede eksplantationsundersøgelser rekapitulere det multiaksiale mekaniske belastningsmiljø, der genereres af senepåvirkning in vivo, hvilket afhænger af anatomiske træk i det impingerede område ^5,6. I forbindelse med indsættelsen af den impingerede akillessene omfatter dette omgivende væv såsom retrocalcaneal bursa og Kagers fedtpude 60,61,62,63. Omvendt tillader in vivo-modeller af senepåvirkning 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontrol over størrelsen og hyppigheden af belastning, der påføres direkte på senen, hvilket er en velkendt begrænsning af in vivo-modeller til undersøgelse af senemekanobiologi^57,58,67,68,69,70. På grund af udfordringer med at måle senebelastning in vivo er det interne belastningsmiljø, der genereres i disse modeller, ofte dårligt karakteriseret.

I dette manuskript præsenterer vi en brugerdefineret eksperimentel platform, der genskaber impingement af akillesseneindsættelsen på calcaneus inden for hele murin bagbenseksplanter, der, når de parres med denne vævskulturprotokol, opretholder levedygtighed over 7 dage i explantagekultur og giver mulighed for undersøgelse af de biologiske følgevirkninger af senepåvirkning. Platformen er bygget på en 3D-printet polymælkesyrebase (PLA), der danner grundlaget for fastgørelsen af grebene og 3D-printet PLA-volumenreduktionsindsats. Grebene bruges til at klemme overbenet og knæet proksimalt til Achilles myotendinøse kryds med det kaudale aspekt af bagbenet opad, så akillessenen kan afbildes ovenfra ved hjælp af en ultralydssonde eller omvendt mikroskop (figur 1A). Volumenreduktionsindsatsen glider langs et spor på basen og reducerer det krævede volumen vævskulturmedier. En flettet linje viklet rundt om bagpoten føres ud af platformen ved hjælp af basisdesignet og et 3D-trykt PLA-klip. Ved at trække i snoren er bagpoten dorsiflexed, og akillesseneindsættelsen er stødt mod calcaneus, hvilket resulterer i forhøjet tværgående trykbelastning ^5,6 (figur 1A). Platformen er indeholdt i et akrylbad, der opretholder bagbenet eksplanter nedsænket i vævskulturmedier. Fastgørelse af den stramme streng til ydersiden af badet med tape opretholder ankeldorsiflexion for at producere statisk impingement af akillesseneindsættelsen. CAD-filer til 3D-printede komponenter leveres i flere formater (supplerende fil 1), hvilket giver mulighed for import til en række kommercielle og gratis open source CAD-software til modifikation, der passer til eksperimentelle behov. Hvis adgang til 3D-printere ikke er tilgængelig til fremstilling, kan CAD-filer leveres til online 3D-udskrivningstjenester, der udskriver og sender delene til lave omkostninger.

Det er vigtigt, at triceps surae-Achilles musculotendinous kompleks spænder over både knæ- og ankelled 71,72,73. Derfor påvirkes trækbelastning i akillessenen af knæbøjning. Knæforlængelse placerer akillessenen under spænding, mens knæbøjning reducerer spændinger. Ved først at strække knæet ud og derefter passivt dorsiflexere anklen, kan trykbelastninger ved den impingerede indsættelse overlejres på trækstammer. Omvendt, ved passivt dorsiflexing anklen med knæet bøjet, reduceres trækbelastningen, og trykbelastningen forbliver. Den nuværende protokol undersøger tre sådanne betingelser. 1) Ved statisk påvirkning er foden dorsiflexet til < 110° i forhold til skinnebenet for at ramme indsættelsen, med knæet bøjet for at reducere spændingen. 2) For baseline-spændingsgruppen forlænges anklen over 145 ° dorsiflexion med knæet strakt ud, hvilket genererer overvejende trækbelastning ved indsættelsen. 3) For den ubelastede gruppe dyrkes eksplanter i en petriskål med knæ og ankel i neutrale positioner i fravær af eksternt påført belastning. De ovenfor nævnte vinkler måles fotografisk i forhold til et koordinatsystem, hvor foden og skinnebenet er parallelle i en vinkel på 180° og vinkelret i en vinkel på 90°.

De vigtigste trin i protokollen omfatter 1) dissektion af bagbenseksplanter og omhyggelig fjernelse af hud og planttaris sener; 2) eksplantekultur efter en 48 timers forbehandling af dexamethason; 3) vævssektionering og histologisk farvning; og 4) farvebilledanalyse for at vurdere fibrobruskdannelse. Efter dissektion forbehandles hver eksplantation af bagekstremiteter i 48 timer i dyrkningsmedier suppleret med dexamethason⁷⁴. Kontralaterale lemmer fra hver mus tildeles separate eksperimentelle grupper til parvis sammenligning, hvilket hjælper med at kontrollere biologisk variabilitet. Efter forbehandling placeres eksplanter i platforme som beskrevet ovenfor og dyrkes i yderligere 7 dage (figur 1B). Yderligere sammenligninger foretages med en forbehandlet (dag 0) gruppe, hvor eksplantater fjernes umiddelbart efter 48 timers forbehandling.

Efter explant-kultur trimmes bagbenene ned, formalin fikseres, afkalkes og indlejres i paraffin. Seriel sektionering i sagittal orientering giver visualisering af akillessenen fra det myotendinøse kryds til calcaneal indsættelse, samtidig med at sektionsdybden kan spores gennem hele senen. Terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT)-medieret dUTP X-nick-mærkning (TUNEL) bruges til at visualisere DNA-skade sekundært til apoptose og vurdere levedygtighed. Toluidinblå histologi og brugerdefineret farvebilledanalyse udføres for at kvantificere ændringer i GAG-farvning. Toluidinblå farvede vævssektioner bruges derefter til SHG-billeddannelse til at karakterisere ændringer i collagefiberorganisation (figur 1B).

De fremlagte repræsentative resultater tyder på ændret histologisk farvning af den GAG-rige matrix og disorganisering af det ekstracellulære kollagennetværk genereret af 7 dages statisk impingement i modellen. Denne model kan bruges til at udforske molekylære mekanismer, der ligger til grund for impingement-drevet fibrocartilaginøs ændring.

Protocol

Alt dyrearbejde blev godkendt af University of Rochester Committee on Animal Resources. 1. Fremstilling af vævskulturmedier Kultur alle eksplanter i Dulbeccos modificerede ørnemedium (1x DMEM) med 1% v / v penicillin-streptomycin og 200 μM L-ascorbinsyre i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Til den indledende 48 timers forbehandling dyrkes hver enkelt i 70 ml dyrkningsmedier suppleret med 100 nM dexamethason74. Efter forbehandli…

Representative Results

Repræsentative billeder af TUNEL farvede vævssektioner viser minimale apoptotiske kerner i kroppen af akillessenen efter 7 dages eksplantatkultur på tværs af eksperimentelle grupper (figur 2A). Kvantificering af disse billeder giver bevis for, at vævskulturprotokollen opretholder op til 78% levedygtighed i gennemsnit inden for akillessenen efter 7 dages eksplantatkultur under belastningsforhold (figur 2B). Kvalitativt værdsætte…

Discussion

Den eksperimentelle murine bagbenseksplantatplatform parret med vævskulturprotokollen beskrevet i denne undersøgelse giver en passende model til undersøgelse af mekanobiologien af impingementdrevet fibrocartilagedannelse ved indsættelsen af akillessenen. Nytten af denne explant-model demonstreres af de repræsentative resultater, som indikerer vedligeholdelse af cellelevedygtighed samtidig med signifikant og rumligt heterogen ændring i toluidinblå farvning efter 7 dages statisk impingement. Disse resultater tyder p…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining