إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي النخوي إلى تعدد القدرات
Summary
يصف البروتوكول الحالي إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) والخلايا الظهارية البنكرياسية القنية الطبيعية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs). نحن نقدم إجراء محسنا ومفصلا خطوة بخطوة ، من تحضير فيروس العدس إلى إنشاء خطوط iPSC مستقرة.
Abstract
تم تحقيق توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام عوامل النسخ من أي نوع من الخلايا المتمايزة تقريبا وأثبتت قيمتها العالية للبحث والتطبيقات السريرية. ومن المثير للاهتمام ، أن إعادة برمجة iPSC للخلايا السرطانية ، مثل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) ، قد ثبت أنها تعيد النمط الظاهري ل PDAC الغازي وتتجاوز الجينوم السرطاني. يمكن أن يلخص تمايز iPSCs المشتقة من PDAC تطور PDAC من سلائف الأورام داخل الظهارة البنكرياسية المبكرة (PanIN) ، مما يكشف عن التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث مبكرا أثناء تطور PDAC. لذلك ، يمكن استخدام iPSCs المشتقة من PDAC لنمذجة المراحل المبكرة من PDAC لاكتشاف علامات التشخيص المبكرة الكشف. هذا مهم بشكل خاص لمرضى PDAC ، الذين يتم تشخيصهم عادة في المراحل النقيلية المتأخرة بسبب نقص المؤشرات الحيوية الموثوقة لمراحل PanIN السابقة. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة خطوط الخلايا السرطانية ، بما في ذلك PDAC ، إلى تعدد القدرات لا يزال يمثل تحديا وكثيف العمالة ومتغيرا للغاية بين الخطوط المختلفة. هنا ، نصف بروتوكولا أكثر اتساقا لتوليد iPSCs من خطوط خلايا PDAC البشرية المختلفة باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية bicistronic . خطوط iPSC الناتجة مستقرة ، ولا تظهر أي اعتماد على التعبير الخارجي لعوامل إعادة البرمجة أو الأدوية المحرضة. بشكل عام ، يسهل هذا البروتوكول توليد مجموعة واسعة من iPSCs المشتقة من PDAC ، وهو أمر ضروري لاكتشاف المؤشرات الحيوية المبكرة الأكثر تحديدا وتمثيلا لحالات PDAC.
Introduction
يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) أحد أكثر الأورام الخبيثة فتكا ، ولا يزال التشخيص المبكر يمثل تحديا بسبب الطبيعة الخالية من الأعراض للمرض. يتم تشخيص غالبية مرضى PDAC في المرحلة النقيلية المتقدمة عندما تتوفر خيارات علاج محدودة للغاية 1,2. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود مؤشرات حيوية موثوقة للمراحل المبكرة ، مثل تلك التي يمكن اكتشافها بسهولة كبروتينات يتم إطلاقها في مجرى الدم.
يمكن أن ينتشر PDAC في وقت مبكر جدا أثناء تقدمه ، وقد تم ربط التشخيص الأفضل بالكشف المبكر عن السرطان عندما يكون PDAC موضعيا في البنكرياس3. ومع ذلك ، يتم تشخيص أقل من عشر مرضى PDAC بتشخيص إيجابي ، مما يسمح بالاستئصال الجراحي. ومع ذلك ، فإن أولئك القلائل الذين يعانون من أورام قابلة للاستئصال معرضون أيضا لتكرار الورم في غضون 12 شهرا4.
في العقود الخمسة الماضية ، تم إجراء تحسينات ملحوظة في التقنيات الجراحية ورعاية المرضى وطرق العلاج 5,6. ومع ذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات في مرضى PDAC الذين تم استئصالهم جراحيا بالكاد ارتفع إلى 17٪. ومع ذلك ، لا يزال هذا أفضل من ذلك في المرضى غير المستأصلين ، والذي ظل دون تغيير تقريبا (0.9٪) 4,7. العلاج الكيميائي هو العلاج البديل الوحيد الآخر PDAC. ومع ذلك ، فإن هذا الخيار محدود للغاية لأن الغالبية العظمى من مرضى PDAC يظهرون مقاومة قوية لأدوية العلاج الكيميائي مثل Gemcitabine 7,8. الأدوية الأخرى ، مثل Erlotinib ، متاحة فقط لمجموعة صغيرة من مرضى PDAC الذين يعانون من طفرات محددة ، ومعظمهم يظهرون مقاومة Erlotinib9. الآثار الجانبية الضارة المرتبطة بالعلاج الكيميائي في معظم مرضى PDAC هي عيب آخر لهذا العلاج10. في الآونة الأخيرة ، أظهرت الاستراتيجيات الواعدة أن مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs) ومثبطات كيناز الجزيئات الصغيرة (SMKIs) يمكن أن تكون فعالة في علاج PDAC ، لكن الاستجابات الدائمة لهذه العلاجات المستهدفة لا تزال تقتصر على أقلية من المرضى11,12. بشكل عام ، يمكن أن يمهد اكتشاف المؤشرات الحيوية المبكرة الخاصة ب PDAC طرقا جديدة للتشخيص والعلاج المبكرين.
يتطور PDAC من آفات السلائف داخل البنكرياس داخل الظهارة (PanIN) التي تنتج عن التكاثر الظهاري للقناة البنكرياسية غير الغازية13,14. في حين أن تكوين PanIN يبدأ بواسطة طفرات جينية مسرطنة مثل KRAS ، هناك حاجة إلى تغييرات جينية وجينية إضافية للتقدم إلى PDAC. من المتوقع أن يستغرق تقدم PanIN خلال المراحل المختلفة إلى PDAC الغازية حوالي 10 سنوات13،15،16،17. يوفر هذا الإطار الزمني فرصة رائعة للاستفادة من التشخيص المبكر ل PDAC. لذلك ، تم إجراء بحث مكثف لإنشاء نماذج حيوانية للورم xenograft ومزارع عضوية لدراسة تقدم PDAC18،19،20،21. كانت هذه النماذج مفيدة جدا لدراسة المراحل الغازية من PDAC ، على الرغم من عدم الانتقال من مراحل PanIN المبكرة. لذلك ، من المهم تطوير نماذج تجريبية يمكنها تلخيص التقدم المبكر لمراحل PanIN لتمكين اكتشاف المؤشرات الحيوية للكشف المبكر.
إن إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام عوامل النسخ الأربعة OCT4 و SOX2 و KLF4 و c-MYC (OSKM) قد أوضحت مدى اللدونة الخلوية22. تم توثيق لدونة الخلايا السرطانية جيدا ، وتم استخدام إعادة برمجة الخلايا السرطانية البشرية إلى iPSCs بنجاح لإعادة الخلايا إلى حالتها الخلوية الأصلية ، وإزالة العديد من الإهانات اللاجينية التي تراكمت أثناء تطور السرطان23،24،25،26،27،28،29. وبالتالي ، فإن إمكانية استخدام استراتيجية إعادة البرمجة هذه للتلاعب بهوية الخلايا السرطانية قد قدمت وعدا كبيرا في علاج السرطان30,31. في الواقع ، لقد أظهرنا سابقا أن تمايز iPSCs المشتقة من PDACs يمكن أن يلخص تقدم PDAC خلال مراحل PanIN المبكرة32. من خلال تحديد الجينات والمسارات الخاصة بالمراحل المبكرة إلى المتوسطة من PDAC ، تم تحديد المؤشرات الحيوية المرشحة التي يمكن استخدامها سريريا لتشخيص PDAC المبكر32,33. ومع ذلك ، أظهرت المؤشرات الحيوية المكتشفة باستخدام خط iPSC واحد تغطية محدودة في غالبية مرضى PDAC32. أدت تحديات توليد خطوط iPSC من مرضى PDAC الآخرين إلى إيقاف القدرة على اكتشاف مؤشرات حيوية أكثر موثوقية. ويرجع ذلك إلى العديد من العوامل التقنية ، بما في ذلك عدم تجانس توصيل OSKM ، حيث احتوى جزء صغير فقط من خلايا PDAC الأولية البشرية على جميع العوامل الأربعة واستجاب بنجاح لإعادة البرمجة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعادة برمجة خلايا PDAC الأولية باستخدام توصيل فيروسي مزدوج أكثر كفاءة واتساقا ل OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
To facilitate the use of iPSC reprogramming for studying cancer progression, a robust protocol has been established for reprogramming pancreatic cancer cells. Reprogramming cancer cells into pluripotency has proven to be very challenging thus far, as only a few studies have successfully generated iPSCs from cancer cells32,36,37,38,39,<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S and J.K would like to thank Cancer Research UK and OHSU for funding (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S is supported by an MRC career development award (MR/N024028/1). A.A is funded by a Ph.D. scholarship (Scholarship ref. 1078107040) from King Abdulaziz City for Science and Technology. J.K is funded by MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) and Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). We thank Prof Keisuke Kaji for kindly providing the reprogramming vector pSIN4-EF1a-O2S and pSIN4-CMV-K2M. For the purpose of open access, the author has applied a Creative Commons Attribution (CC BY) licence to any Author Accepted Manuscript version arising from this submission.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Ricerca sul cancro. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Ricerca sul cancro. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors’ initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
