Herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier naar pluripotentie
Summary
Het huidige protocol beschrijft de herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) en normale ductale epitheelcellen van de pancreas tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s). We bieden een geoptimaliseerde en gedetailleerde, stapsgewijze procedure, van het bereiden van lentivirus tot het opzetten van stabiele iPSC-lijnen.
Abstract
De generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) met behulp van transcriptiefactoren is bereikt uit bijna elk gedifferentieerd celtype en is zeer waardevol gebleken voor onderzoek en klinische toepassingen. Interessant is dat iPSC-herprogrammering van kankercellen, zoals ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC), is aangetoond dat het het invasieve PDAC-fenotype omkeert en het kankerepigenoom opheft. De differentiatie van PDAC-afgeleide iPSC’s kan PDAC-progressie recapituleren van de vroege voorloper van intra-epitheliale neoplasie (PanIN) van de pancreas, waardoor de moleculaire en cellulaire veranderingen worden onthuld die vroeg optreden tijdens PDAC-progressie. Daarom kunnen PDAC-afgeleide iPSC’s worden gebruikt om de vroegste stadia van PDAC te modelleren voor de ontdekking van diagnostische markers voor vroege detectie. Dit is vooral belangrijk voor PDAC-patiënten, die doorgaans worden gediagnosticeerd in de late metastatische stadia vanwege een gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de eerdere PanIN-stadia. Het herprogrammeren van kankercellijnen, waaronder PDAC, in pluripotentie blijft echter een uitdaging, arbeidsintensief en zeer variabel tussen verschillende lijnen. Hier beschrijven we een consistenter protocol voor het genereren van iPSC’s uit verschillende menselijke PDAC-cellijnen met behulp van bicistronische lentivirale vectoren. De resulterende iPSC-lijnen zijn stabiel en vertonen geen afhankelijkheid van de exogene expressie van herprogrammerende factoren of induceerbare geneesmiddelen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit protocol het genereren van een breed scala aan PDAC-afgeleide iPSC’s, wat essentieel is voor het ontdekken van vroege biomarkers die specifieker en representatiever zijn voor PDAC-gevallen.
Introduction
Ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) is een van de meest fatale maligniteiten en een vroege diagnose blijft een uitdaging vanwege de asymptomatische aard van de ziekte. De meerderheid van de PDAC-patiënten wordt gediagnosticeerd in het gevorderde gemetastaseerde stadium wanneer zeer beperkte behandelingsopties beschikbaar zijn 1,2. Dit is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de vroege stadia, zoals die welke gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd als eiwitten die in de bloedbaan vrijkomen.
PDAC kan zich zeer vroeg tijdens de progressie verspreiden en een betere prognose is in verband gebracht met vroege detectie van kanker wanneer PDAC is gelokaliseerd in de alvleesklier3. Minder dan een tiende van de PDAC-patiënten wordt echter gediagnosticeerd met een gunstige prognose, waardoor chirurgische resectie mogelijk is. Desalniettemin zijn die weinigen met resectabele tumoren ook vatbaar voor tumorrecidief binnen 12 maanden4.
In de afgelopen vijf decennia zijn opmerkelijke verbeteringen aangebracht in chirurgische technieken, patiëntenzorg en behandelingsmodaliteiten 5,6. De 5-jaarsoverleving bij chirurgisch verwijderde PDAC-patiënten is echter nauwelijks gestegen tot 17%. Dit is echter nog steeds beter dan dat bij niet-gereseceerde patiënten, dat vrijwel onveranderd is gebleven (0,9%)4,7. Chemotherapie is de enige andere alternatieve PDAC-behandeling. Toch is deze optie zeer beperkt, aangezien de overgrote meerderheid van de PDAC-patiënten een sterke resistentie vertoont tegen chemotherapiemedicijnen zoals Gemcitabine 7,8. Andere geneesmiddelen, zoals erlotinib, zijn alleen beschikbaar voor een kleine groep PDAC-patiënten met specifieke mutaties, van wie de meesten erlotinib-resistentie vertonen9. De nadelige bijwerkingen die gepaard gaan met chemotherapie bij de meeste PDAC-patiënten zijn nog een ander nadeel van dezebehandeling10. Onlangs hebben veelbelovende strategieën aangetoond dat immuuncheckpointremmers (ICI’s) en small molecule kinaseremmers (SMKI’s) effectief kunnen zijn bij de behandeling van PDAC, maar duurzame reacties op deze gerichte therapieën blijven beperkt tot een minderheid van de patiënten11,12. Over het algemeen kan de ontdekking van PDAC-specifieke vroege biomarkers nieuwe wegen effenen voor vroege diagnose en behandeling.
PDAC ontwikkelt zich uit voorloperlaesies van intra-epitheliale neoplasmata van de pancreas (PanIN) die het gevolg zijn van niet-invasieve proliferaties van het epitheel van de ductus pancreaticus13,14. Hoewel de vorming van PanIN wordt geïnitieerd door oncogenmutaties zoals KRAS, zijn aanvullende genetische en epigenetische veranderingen vereist voor de progressie naar PDAC. Er is voorspeld dat de progressie van PanIN door de verschillende stadia naar invasieve PDAC ongeveer 10 jaar duurt 13,15,16,17. Dit tijdsbestek biedt een geweldige kans om te profiteren van een vroege PDAC-diagnose. Daarom is er uitgebreid onderzoek gedaan om tumor-xenotransplantaatdiermodellen en organoïdeculturen vast te stellen om PDAC-progressie 18,19,20,21 te bestuderen. Deze modellen zijn zeer nuttig geweest voor het bestuderen van de invasieve stadia van PDAC, hoewel niet de overgang van de vroege PanIN-fasen. Het is daarom belangrijk om experimentele modellen te ontwikkelen die de vroege progressie van PanIN-stadia kunnen samenvatten om de ontdekking van biomarkers voor vroege detectie mogelijk te maken.
Het herprogrammeren van somatische cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) met behulp van de vier transcriptiefactoren OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC (OSKM) heeft de mate van cellulaire plasticiteit geïllustreerd22. De plasticiteit van kankercellen is goed gedocumenteerd en het herprogrammeren van menselijke kankercellen in iPSC’s is met succes gebruikt om cellen terug te zetten naar hun oorspronkelijke cellulaire toestand, waardoor veel van de epigenetische beledigingen die zich tijdens de progressie van kanker hebben opgehoopt, zijn verwijderd 23,24,25,26,27,28,29. De mogelijkheid om deze herprogrammeringsstrategie te gebruiken om de identiteit van kankercellen te manipuleren, is daarom veelbelovend bij de behandeling van kanker30,31. We hebben inderdaad eerder aangetoond dat de differentiatie van iPSC’s afgeleid van PDAC’s de PDAC-progressie door de vroege PanIN-stadia kan recapituleren32. Door genen en routes te identificeren die specifiek zijn voor de vroege tot intermediaire stadia van PDAC, werden kandidaat-biomarkers geïdentificeerd die klinisch kunnen worden gebruikt voor vroege PDAC-diagnose32,33. De biomarkers die werden ontdekt met behulp van een enkele iPSC-lijn vertoonden echter een beperkte dekking bij de meerderheid van de PDAC-patiënten32. De uitdagingen van het genereren van iPSC-lijnen van andere PDAC-patiënten hebben het vermogen om betrouwbaardere biomarkers te ontdekken tot stilstand gebracht. Dit is te wijten aan vele technische factoren, waaronder de heterogeniteit van OSKM-afgifte, aangezien slechts een klein deel van de menselijke primaire PDAC-cellen alle vier de factoren bevatte en met succes reageerde op herprogrammering. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het herprogrammeren van primaire PDAC-cellen met behulp van een efficiëntere en consistentere dubbele lentivirale toediening van OSKM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om het gebruik van iPSC-herprogrammering voor het bestuderen van kankerprogressie te vergemakkelijken, is een robuust protocol opgesteld voor het herprogrammeren van alvleesklierkankercellen. Het herprogrammeren van kankercellen tot pluripotentie is tot nu toe een grote uitdaging gebleken, aangezien slechts enkele onderzoeken met succes iPSC’s hebben gegenereerd uit kankercellen 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S en J.K willen Cancer Research UK en OHSU bedanken voor de financiering (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S wordt ondersteund door een MRC career development award (MR/N024028/1). AA wordt gefinancierd door een Ph.D. beurs (Scholarship ref. 1078107040) van King Abdulaziz City for Science and Technology. JK wordt gefinancierd door MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) en Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Wij danken Prof. Keisuke Kaji voor het beschikbaar stellen van de herprogrammeervector pSIN4-EF1a-O2S en pSIN4-CMV-K2M. Ten behoeve van open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Ricerca sul cancro. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Ricerca sul cancro. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors’ initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
