प्लुरिपोटेंसी के लिए अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा को पुन: प्रोग्रामिंग करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में अग्नाशय डक्टल Adenocarcinoma (PDAC) और सामान्य अग्नाशय वाहिनी उपकला कोशिकाओं के reprogramming का वर्णन करता है. हम एक अनुकूलित और विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करते हैं, लेंटवायरस तैयार करने से लेकर स्थिर आईपीएससी लाइनों की स्थापना तक।
Abstract
प्रतिलेखन कारकों का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) की पीढ़ी लगभग किसी भी विभेदित सेल प्रकार से प्राप्त की गई है और अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक मूल्यवान साबित हुई है। दिलचस्प बात यह है कि कैंसर कोशिकाओं के आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग, जैसे अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी), को आक्रामक पीडीएसी फेनोटाइप को वापस करने और कैंसर एपिजेनोम को ओवरराइड करने के लिए दिखाया गया है। PDAC-व्युत्पन्न IPSC का भेदभाव PDAC प्रगति को अपने प्रारंभिक अग्नाशयी intraepithelial नियोप्लासिया (PanIN) अग्रदूत से पुनरावृत्ति कर सकता है, PDAC प्रगति के दौरान जल्दी होने वाले आणविक और सेलुलर परिवर्तनों का खुलासा करता है। इसलिए, PDAC-व्युत्पन्न IPSC प्रारंभिक पहचान नैदानिक मार्करों की खोज के लिए PDAC के शुरुआती चरणों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह पीडीएसी रोगियों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जिन्हें आमतौर पर पहले पैनिन चरणों के लिए विश्वसनीय बायोमार्कर की कमी के कारण देर से मेटास्टेटिक चरणों में निदान किया जाता है। हालांकि, पीडीएसी सहित कैंसर सेल लाइनों को प्लुरिपोटेंसी में पुन: प्रोग्रामिंग करना चुनौतीपूर्ण, श्रम-गहन और विभिन्न लाइनों के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील रहता है। यहाँ, हम bicistronic lentiviral वैक्टर का उपयोग कर विभिन्न मानव PDAC सेल लाइनों से IPSC उत्पन्न करने के लिए एक और अधिक सुसंगत प्रोटोकॉल का वर्णन. परिणामस्वरूप IPSC लाइनों स्थिर हैं, reprogramming कारकों या inducible दवाओं के exogenous अभिव्यक्ति पर कोई निर्भरता दिखा. कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल पीडीएसी-व्युत्पन्न आईपीएससी की एक विस्तृत श्रृंखला की पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है, जो प्रारंभिक बायोमार्कर की खोज के लिए आवश्यक है जो पीडीएसी मामलों के अधिक विशिष्ट और प्रतिनिधि हैं।
Introduction
अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे घातक विकृतियों में से एक है, और रोग की स्पर्शोन्मुख प्रकृति के कारण प्रारंभिक निदान चुनौतीपूर्ण रहता है। पीडीएसी रोगियों के बहुमत उन्नत मेटास्टेटिक चरण में निदान कर रहे हैं जब बहुत सीमित उपचार विकल्प 1,2 उपलब्ध हैं. यह मुख्य रूप से पहले के चरणों के लिए विश्वसनीय बायोमाकर्स की कमी के कारण है, जैसे कि वे जिन्हें रक्तप्रवाह में जारी प्रोटीन के रूप में आसानी से पता लगाया जा सकता है।
PDAC अपनी प्रगति के दौरान बहुत जल्दी प्रसार कर सकते हैं, और एक बेहतर रोग का निदान प्रारंभिक कैंसर का पता लगाने के लिए जोड़ा गया है जब PDAC अग्न्याशय3 में स्थानीयकृत है. हालांकि, पीडीएसी रोगियों के दसवें से भी कम एक अनुकूल रोग का निदान किया जाता है, जिससे सर्जिकल लकीर की अनुमति मिलती है। बहरहाल, रिसेक्टेबल ट्यूमर वाले कुछ लोग 12 महीने4 के भीतर ट्यूमर पुनरावृत्ति के लिए भी प्रवण होते हैं।
पिछले पांच दशकों में, शल्य चिकित्सा तकनीकों, रोगी देखभाल, और उपचारके तौर-तरीकों 5,6 में उल्लेखनीय सुधार किए गए हैं। हालांकि, शल्य चिकित्सा से पीड़ित पीडीएसी रोगियों में 5 साल की जीवित रहने की दर मुश्किल से 17% तक बढ़ी है। बहरहाल, यह अभी भी गैर-विच्छेदित रोगियों की तुलना में बेहतर है, जो लगभग अपरिवर्तित (0.9%)4,7बना हुआ है। कीमोथेरेपी एकमात्र अन्य वैकल्पिक पीडीएसी उपचार है। फिर भी, यह विकल्प बहुत सीमित है क्योंकि पीडीएसी रोगियों के महान बहुमत जेमसिटाबाइन 7,8 जैसे कीमोथेरेपी दवाओं के लिए मजबूत प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। अन्य दवाएं, जैसे कि एर्लोटिनिब, केवल विशिष्ट उत्परिवर्तन वाले पीडीएसी रोगियों के एक छोटे समूह के लिए उपलब्ध हैं, जिनमें से अधिकांश एर्लोटिनिब प्रतिरोध9 दिखाते हैं। अधिकांश पीडीएसी रोगियों में कीमोथेरेपी से जुड़े प्रतिकूल दुष्प्रभाव इस उपचार का एक और नुकसान हैं10. हाल ही में, आशाजनक रणनीतियों से पता चला है कि प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों (आईसीआई) और छोटे अणु किनेज अवरोधकों (एसएमकेआई) पीडीएसी के इलाज में प्रभावी हो सकता है, लेकिन इन लक्षित उपचारों के लिए टिकाऊ प्रतिक्रियाएंरोगियों 11,12 के अल्पसंख्यक तक सीमित रहती हैं। कुल मिलाकर, पीडीएसी-विशिष्ट प्रारंभिक बायोमार्कर की खोज प्रारंभिक निदान और उपचार के लिए नए मार्ग प्रशस्त कर सकती है।
PDAC अग्नाशयी intraepithelial neoplasms (PanIN) अग्रदूत घावों है कि गैर इनवेसिव अग्नाशयी वाहिनी उपकला प्रसार13,14 से परिणाम से विकसित करता है. जबकि पैनआईएन का गठन केआरएएस जैसे ऑन्कोजीन म्यूटेशन द्वारा शुरू किया जाता है, पीडीएसी की प्रगति के लिए अतिरिक्त आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह अनुमान लगाया गया है कि आक्रामक पीडीएसी में विभिन्न चरणों के माध्यम से पैनिन की प्रगति में लगभग 10 वर्ष लगते हैं 13,15,16,17. यह समय सीमा प्रारंभिक पीडीएसी निदान से लाभ उठाने का एक शानदार अवसर प्रदान करती है। इसलिए, पीडीएसी प्रगति 18,19,20,21का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट पशु मॉडल और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए व्यापक शोध किया गया है। ये मॉडल पीडीएसी के आक्रामक चरणों का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी रहे हैं, हालांकि शुरुआती पैनिन चरणों से संक्रमण नहीं। इसलिए, प्रयोगात्मक मॉडल विकसित करना महत्वपूर्ण है जो प्रारंभिक पहचान बायोमार्कर की खोज को सक्षम करने के लिए पैनिन चरणों की प्रारंभिक प्रगति को पुन: व्यवस्थित कर सकते हैं।
चार प्रतिलेखन कारकों OCT4, SOX2, KLF4, और c-MYC (OSKM) का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (IPSC) में दैहिक कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग ने सेलुलर प्लास्टिसिटी22 की सीमा को चित्रित किया है। कैंसर सेल प्लास्टिसिटी को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, और आईपीएससी में मानव कैंसर कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करने के लिए कोशिकाओं को उनके मूल सेलुलर राज्य में रीसेट करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, कैंसर की प्रगति 23,24,25,26,27,28,29 के दौरान जमा हुए कई एपिजेनेटिक अपमान को हटा रहा है. कैंसर सेल पहचान में हेरफेर करने के लिए इस reprogramming रणनीति का उपयोग करने की संभावना है, इसलिए, कैंसर30,31 के इलाज में महान वादा प्रस्तुत किया है. दरअसल, हमने पहले दिखाया है कि पीडीएसी से व्युत्पन्न आईपीएससी का भेदभाव प्रारंभिक पैनआईएन चरणों32 के माध्यम से पीडीएसी प्रगति को पुन: व्यवस्थित कर सकता है। पीडीएसी के प्रारंभिक-से-मध्यवर्ती चरणों के लिए विशिष्ट जीन और मार्गों की पहचान करके, उम्मीदवार बायोमार्कर की पहचान की गई थी कि चिकित्सकीय प्रारंभिक पीडीएसी निदान 32,33के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, बायोमार्कर एक एकल आईपीएससी लाइन का उपयोग कर की खोज पीडीएसी रोगियों32 के बहुमत में सीमित कवरेज से पता चला. अन्य PDAC रोगियों से IPSC लाइनों को उत्पन्न करने की चुनौतियों अधिक विश्वसनीय biomarkers की खोज करने की क्षमता रोक दिया है. यह ओएसकेएम वितरण की विषमता सहित कई तकनीकी कारकों के कारण है, क्योंकि मानव प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं के केवल एक छोटे से हिस्से में सभी चार कारक शामिल थे और रीप्रोग्रामिंग के लिए सफलतापूर्वक प्रतिक्रिया दी गई थी। यहां, ओसकेएम के अधिक कुशल और सुसंगत दोहरी लेंटिवायरल डिलीवरी का उपयोग करके प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर प्रगति का अध्ययन करने के लिए IPSC reprogramming के उपयोग की सुविधा के लिए, एक मजबूत प्रोटोकॉल अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं reprogramming के लिए स्थापित किया गया है. प्लुरिपोटेंसी में कैंसर कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिं?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एएस और जेके वित्त पोषण के लिए कैंसर रिसर्च यूके और ओएचएसयू को धन्यवाद देना चाहते हैं (सीआरयूके-ओएचएसयू प्रोजेक्ट अवार्ड C65925/A26986)। एएस एक एमआरसी कैरियर विकास पुरस्कार (एमआर / N024028/1) द्वारा समर्थित है। एए को विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए किंग अब्दुलअजीज सिटी से पीएचडी छात्रवृत्ति (छात्रवृत्ति संदर्भ 1078107040) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। जेके को एमआरएफ न्यू इन्वेस्टिगेटर ग्रांट (GCNCR1042A) और नाइट सीडर ग्रांट (68182-933-000, 68182-939-000) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम प्रोफेसर कीसुके काजी को कृपया रीप्रोग्रामिंग वेक्टर pSIN4-EF1a-O2S और pSIN4-CMV-K2M प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बाय) लाइसेंस लागू किया है।
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
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